Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC
20 de junho de 2025
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.
O escopo de nossa pesquisa se concentra na função das células imunes após o AVC isquêmico. Nosso objetivo é entender as leis das células imunes residentes e infiltrantes na patologia do AVC. Atualmente, a citometria de fluxo é amplamente utilizada para avaliar a função das células imunes e as interações nas neuroinflamações.
Além disso, técnicas imunológicas e célula única e sequenciamento estão avançando na pesquisa em interações neuroimunes. Nosso laboratório se concentrará em ilustrar a rota dos astrócitos em interações neuroimunes, contribuições angiovasculares para processos neuroinflamatórios. Para começar, pegue uma seringa de 50 mililitros e prenda uma agulha de calibre 26 na extremidade.
Encha a seringa completamente com solução salina. Posicione o mouse anestesiado em decúbito dorsal em uma placa de espuma. Estenda os membros anteriores e posteriores e prenda-os usando agulhas de calibre 26.
Usando uma pinça de polegar serrilhada, segure a pele abdominal e faça uma incisão lateral para expor o fígado. Corte ao longo de ambos os lados das costelas para expor o coração. Agora insira a agulha de calibre 26 no ventrículo esquerdo e corte o oráculo direito.
Pressione o êmbolo da seringa para permitir que o sangue escorra. Continue a perfusão até que o sangue drenado do oráculo pareça claro. Depois de decapitar o camundongo e extrair o cérebro, transfira-o para uma matriz cerebral de aço de camundongo e corte-o em fatias consecutivas de córnea de dois milímetros de espessura.
Introduza 500 microlitros de mistura de enzimas de digestão em cada poço de uma placa de 12 poços. Usando uma micropinça, separe delicadamente o tecido do infarto e transfira-o para a mistura de enzimas de digestão. Por fim, fragmente o tecido com uma tesoura oftálmica nos menores pedaços possíveis e incube a placa a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Usando a pipeta AP 1000, aspire suavemente e dispense a solução 10 vezes para dissociar o tecido em células individuais. Em seguida, passe a solução por um filtro de células de 70 micrômetros. Enxágue repetidamente a placa de 12 poços e o filtro de células com HBSS gelado contendo cálcio e magnésio.
Agora centrifugue a suspensão celular coletada a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS.
Depois de repetir o processo de centrifugação, ressuspender novamente o pellet em 150 microlitros de PBS e transferir a suspensão para uma placa inferior redonda de 96 poços. Centrifugue novamente a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, segure firmemente a placa de 96 poços e inverta-a rapidamente para descartar o sobrenadante.
Em seguida, dilua a matriz de fluorescência de viabilidade celular na proporção de um para cem em PBS e ressuspenda o pellet em 150 microlitros da solução de corante diluída. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente, protegendo a placa da luz. Depois de centrifugar durante cinco minutos a quatro graus Celsius, rejeitar o sobrenadante.
Dilua o coquetel de anticorpos da superfície celular na classificação de células ativadas por magnetismo ou tampão máximo e, sem lavar as células, adicione o coquetel de anticorpos aos poços. Incube por 15 a 20 minutos a quatro graus Celsius antes de centrifugar por mais cinco minutos. Depois de centrifugar a placa e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 150 microlitros de tampão máximo.
Transfira a suspensão para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro ou tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Projete um painel de citometria de fluxo multicolorido de acordo com a configuração do instrumento usando métodos manuais ou uma ferramenta de design de painel online. Inclua um corante de viabilidade celular no painel para excluir células não viáveis e detritos dos dados.
Ajuste as configurações do detector de dispersão frontal e lateral para garantir que as células de interesse sejam exibidas corretamente e possam ser fechadas corretamente. Ajuste os parâmetros FSC e SSC para eliminar detritos e ruídos estranhos. Em um gráfico de pontos mostrando a área do FSC versus a altura, distinga os dupletos das células individuais.
Use o sinal negativo do corante de viabilidade para isolar as células viáveis. Compare o controle de autofluorescência de células não coradas com controles positivos de células coradas para confirmar se as células coradas estão dimensionadas corretamente para cada parâmetro. Ajuste a compensação analisando amostras de células multicoloridas e examinando gráficos de pontos de duas cores.
Ajuste as configurações de compensação para cima ou para baixo até que as populações de células se alinhem vertical ou horizontalmente umas com as outras. Utilize sinais CD45 e CD11B para distinguir entre linfócitos, microglia, células mieloides e astrócitos com base em seus padrões de expressão específicos. Empregue tecido cerebral simulado como controle de autofluorescência para servir como referência para a identificação de linfócitos.
Se estiver analisando um alvo específico, utilize um controle FMO com tecido cerebral pós-AVC. Colete os dados de controle e salve-os. Da mesma forma, colete os dados de amostra e salve-os.
Selecione e classifique as populações de células-alvo em tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros ou tubos de centrífuga cônicos de 15 mililitros. Adicione 500 microlitros de PBS e enxágue o tubo de coleta para preservar a viabilidade celular e ajudar na formação de pellets. As microglias positivas para CCR7 e CD11c positivas foram quantificadas nos dias dois e sete após o AVC isquêmico.
A expressão de CCR7 na microglia aumentou acentuadamente no segundo dia e permaneceu elevada no sétimo dia em comparação com os controles simulados. A microglia CD11c positiva seguiu uma tendência semelhante, atingindo o pico no segundo dia e permanecendo mais alta do que a simulada no sétimo dia. Os gráficos de pontos mostraram sinais densos de CCR7 e CD11c nos dias dois e sete.
Contrastando com sinais esparsos em controles simulados. Uma estratégia de gating separou as células mielóides da microglia e os linfócitos usando a expressão de CD11B e CD45. Marcadores adicionais definiram células viáveis, astrócitos e subconjuntos de linfócitos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para avaliar a função de células imunes após acidente vascular cerebral isquêmico utilizando análise citométrica de fluxo em um modelo de mini-AVC. O método permite um exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para pesquisas sobre diversas doenças neurodegenerativas, aumentando assim a compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Patologia do acidente vascular cerebral
Antecedentes
- Compreender as respostas imunes no acidente vascular cerebral isquêmico é fundamental para o desenvolvimento de terapias.
- As interações neuroimunes são um fator-chave que influencia os resultados do acidente vascular cerebral.
- Os modelos existentes frequentemente carecem de capacidades detalhadas de análise das funções imunes.
- Este estudo tem como objetivo preencher essa lacuna utilizando citometria de fluxo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para avaliar a função das células imunes após acidente vascular cerebral isquêmico.
- Investigar as interações neuroimunes em um modelo de miniacidente vascular cerebral.
- Ampliar a compreensão das respostas imunes em doenças neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- A análise por citometria de fluxo foi empregada, permitindo o exame detalhado das funções das células imunes.
- Um modelo de mini-acidente vascular cerebral foi utilizado para simular condições isquêmicas.
- Nenhum fluxo de trabalho de análise multiômica ou metabólica foi mencionado no texto.
- Os passos procedimentais detalhados relativos ao protocolo não foram fornecidos.
- Destaca-se a adaptabilidade do método para diversas doenças neurodegenerativas.
Resultados Principais
- O protocolo permite a avaliação detalhada das respostas das células imunes após acidente vascular encefálico isquêmico.
- Os resultados sugerem insights significativos sobre as interações neuroimunes durante o acidente vascular encefálico.
- A adaptabilidade para outras doenças neurodegenerativas é um insight fundamental.
- As conclusões reforçam a importância de compreender a dinâmica imune na patologia do acidente vascular encefálico.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma metodologia robusta para dissecar respostas imunológicas em acidentes vasculares cerebrais.
- A abordagem aprofunda a compreensão dos mecanismos imunológicos relevantes para a neurodegeneração.
- Os achados têm implicações para o desenvolvimento de terapias direcionadas no manejo do acidente vascular cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa por citometria de fluxo das interações neuroimunes em um modelo murino de miniacidente vascular cerebral permite a caracterização precisa da ativação e infiltração de células imunes após lesão isquêmica. Essa abordagem apoia a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para patologias impulsionadas pela neuroinflamação, orientando decisões em estágios iniciais sobre portfólios em pipelines de doenças neurodegenerativas e cerebrovasculares. A adaptabilidade do protocolo entre modelos de doenças aumenta a continuidade translacional e a confiança preditiva para estratégias terapêuticas imunomoduladoras.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos neuroimunes subjacentes à lesão isquêmica e à neurodegeneração.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a quantificação dos estados de ativação de células imunes após acidente vascular cerebral.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para alvos imunomoduladores em distúrbios do sistema nervoso central.
- Fornece dados para orientar a confiança preditiva e o triagem de ativos em estágios iniciais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece fluxos de trabalho validados de suspensão de células isoladas e marcação com anticorpos para perfilagem imunológica reprodutível.
- Fornece leituras quantitativas e multiparamétricas adequadas para padronização de ensaios e triagem subsequente.
- Permite fenotipagem escalonável de células imunes para avaliação de compostos em contextos neuroinflamatórios.
- Apoia a reutilização da plataforma em modelos de doenças neurodegenerativas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfilamento de células imunes com desfechos relevantes para a doença em modelos pré-clínicos de acidente vascular cerebral e neurodegeneração.
- Permite continuidade da descoberta até a validação pré-clínica de alvos neuroimunes.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em métricas de ativação e infiltração imunes.
- Facilita a identificação de biomarcadores translacionais para processos neuroinflamatórios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se à continuidade descoberta-pré-clínica, apoiando a validação de alvos, a elucidação de mecanismos imunológicos e o desenvolvimento de ensaios quantitativos para programas de doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas.
- Biologia da Descoberta: Fornece dados robustos de ativação e infiltração de células imunes para testes de hipóteses e esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de perfil imune para prontidão de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Permite comparação estatística de populações de células imunes entre condições experimentais e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de respostas imunes pré-clínicas com biomarcadores relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e adaptável para perfil imune em múltiplos modelos de doenças do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuroimunológicos.
- Valor Operacional: Padroniza os protocolos de isolamento de células imunes e citometria de fluxo para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção de projetos e alocação de capital ao fornecer métricas quantitativas de ativação imunológica.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos voltados a doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neuroanatomia, biologia de células imunes e análise de citometria de fluxo.
- Exige acesso a citômetros de fluxo de alto parâmetro e painéis de anticorpos validados.
- Necessita padronização entre equipes para processamento de tecidos e estratégias de seleção de eventos (gating).
- Adaptável a diversos modelos de doenças do SNC com otimização do protocolo conforme o tipo de tecido e o contexto da doença.
- A interpretação dos dados de perfilagem imune pode exigir ensaios funcionais complementares.
