Explorando os eventos celulares sequenciais de fagocitose desencadeados por Godanti Bhasma em células de mamíferos

Fagocitose, onde um fagócito ingere e decompõe partículas estranhas. É crucial para a defesa imunológica. Métodos aprimorados e fáceis de usar são necessários para monitorar e avaliar com eficiência esse complexo processo celular.

Capturar eventos de degradação em tempo real e evitar artefatos de fotobranqueamento continuam sendo os principais desafios no estudo preciso da fagocitose e do tráfego intracelular. Ao contrário da partícula fluorescente ou sintética, nosso protocolo usa Godanti Bhasma, uma partícula sem rótulo que permite a visualização direta dos estágios de fagocitose sem fotobranqueamento, otimização ou preparação complexa. Esses achados fornecem um modelo reprodutível para dissecar mecanismos fagocíticos, oferecendo novas ferramentas para estudar a dinâmica vesicular, disfunção de patógenos e potencial intervenção terapêutica para distúrbios imunológicos e lisossômicos.

Nosso objetivo é explorar os reguladores moleculares do fagossomo da maturação, investigar a disfunção fagocítica em modelos de doenças e rastrear potenciais drogas que modulam a dinâmica vesicular e o tráfego intracelular. Para começar, pese exatamente 100 miligramas de Godanti Bhasma ou pó GB. Suspenda o pó em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina.

Vortex a suspensão completamente para misturar o conteúdo e deixe a mistura repousar por um minuto para permitir que as partículas maiores se depositem no fundo. Usando uma pipeta, transfira os cinco mililitros superiores da suspensão para um tubo de centrífuga estéril. Rotule os cinco mililitros de suspensão GB transferida como a solução de estoque para trabalhos adicionais de cultura de células.

Vortex a suspensão completamente novamente para garantir uma dispersão uniforme das partículas antes de adicioná-la às células. Semeie 3 10 para a quarta potência células 3T3-L1 em um prato de 35 milímetros contendo dois mililitros de DMEM. Incube o prato a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam 70% de confluência.

Em seguida, misture 300 microlitros da suspensão de estoque GB completamente em dois mililitros de meio de cultura fresco pré-aquecido. Coloque a placa de cultura contendo células e suspensão GB na incubadora de platina do microscópio de imagem. Selecione a objetiva 10x no microscópio.

Ligue a iluminação de campo claro usando o botão Brilhante. Em seguida, inicie o software DIGI ImagePlus e selecione a câmera apropriada. Clique no botão Capturar e escolha a opção de lapso de tempo.

Defina o tempo de intervalo para cinco minutos e comece a gravar clicando no botão Concluir. Capture imagens de campo brilhante em intervalos de cinco minutos continuamente por 16 a 24 horas dentro da incubadora de dióxido de carbono do estágio do microscópio. Use o software ImageJ para compilar todas as imagens capturadas em um vídeo com lapso de tempo.

Isso permite a identificação dos estágios de fagocitose desde a internalização da partícula até sua completa degradação. Após 24 horas de crescimento celular em placas de 96 poços, misture bem a suspensão de estoque de partículas GB. Adicione 30 microlitros da suspensão a cada poço.

Use poços sem partículas GB como controles negativos. Incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas para induzir a formação de vacúolos. Para preparar a solução vermelha neutra, dissolva o vermelho neutro para fazer uma solução de 0,5 miligramas por mililitro em DMEM livre de soro.

Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 micrómetros. Para a obtenção de imagens, remova o meio das placas de 96 poços. Depois de adicionar 60 microlitros do corante de filtro a cada poço, incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Lave os poços três vezes com PBS para remover o excesso de corante. Em seguida, prossiga com a imagem microscópica. Examine os vacúolos corados ao microscópio usando a objetiva de 20x para avaliar o tamanho, a morfologia e o número de vacúolos.

Para preparar a solução-mãe de bafilomicina A1, dissolva 100 microgramas do composto em 50 microlitros de dimetilsulfóxido. Em seguida, dilua com 950 microlitros de DMEM. Para a solução de trabalho, diluir um microlitro do estoque em 1,6 mililitros de DMEM para obter uma concentração final de 0,1 nanomolar.

Misture bem a solução de trabalho e adicione 100 microlitros aos poços contendo células nas placas de 96 poços. Em seguida, incube as células em cada poço com 30 microlitros de suspensão de partículas GB para estudar a inibição do vacúolo e da formação de fagossomos. Para inibir a acidificação do fagossomo, adicione 100 microlitros da solução de trabalho de bafilomicina A1 a poços com vacúolos pré-formados previamente tratados com GB. Incube todos os poços a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Adicione 60 microlitros de corante vermelho neutro a cada poço. Incube por 15 minutos a 37 graus Celsius e lave os poços três vezes com PBS para remover o excesso de corante, depois analise a formação e acidificação do vacúolo ao microscópio. Trate as células cultivadas com 50 microlitros de suspensão GB e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono em condições experimentais padrão.

Após o tratamento, adicione solução de laranja de acridina na concentração de um miligrama por mililitro às células e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius para corar vacúolos e organelas vesiculares ácidas. Em seguida, lave as células três vezes com PBS estéril para remover qualquer corante não ligado e reduzir a fluorescência de fundo. Finalmente, analise as lâminas coradas imediatamente usando um microscópio de fluorescência equipado com uma objetiva de 20x e uma faixa de filtro de excitação azul de 450 a 492 nanômetros.

Avalie a morfologia celular e a captação de laranja de acridina para entender a dinâmica vacuolar. Após 30 minutos de tratamento com GB, foram observadas partículas aderidas à superfície de três células 3T3-L1. Uma extensão de membrana semelhante a um copo apareceu ao redor da partícula, indicando o início do engolfamento da partícula.

Às 12 horas após o tratamento, grandes vacúolos ligados à membrana contendo partículas de GB foram observados dentro das células. A imagem de lapso de tempo demonstrou a internalização gradual e a formação de vacúolos em uma única célula viva ao longo de 4,75 horas. As partículas GB dentro dos vacúolos degradaram-se progressivamente ao longo do tempo e a célula recuperou a morfologia normal, conforme indicado pela renovação vacuolar.

A análise de citometria de fluxo mostrou que as partículas internalizadas de Godanti Bhasma foram completamente degradadas em 24 horas, sem que nenhuma partícula permanecesse no meio de cultura. A coloração vermelha neutra revelou acidificação vacúolo significativamente maior em células tratadas com GB de todas as três linhagens celulares em comparação com os controles que exibiram apenas uma coloração lisossômica fraca. A coloração com laranja de acridina mostrou fluorescência vermelho-alaranjada em vacúolos de células GB 3T3-L1 indicando acidificação, enquanto as células não tratadas mostraram apenas fluorescência verde.

O co-tratamento com bafilomicina inibiu a formação de vacúolos nas células 3T3-L1 e HeLa, como evidenciado pela ausência de vacúolos em comparação com seus respectivos controles. Após o tratamento com bafilomicina, a captação de vermelho neutro foi efetivamente bloqueada, interrompendo a acidificação e maturação do vacúolo nas células.