Um pipeline de mistura para gerar unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs) entre besouros ribeirinhos e aquáticos

Buscando acelerar a descoberta de espécies nos trópicos MEGA diversos, este protocolo visa gerar hipóteses de agrupamento de espécies em besouros aquáticos e ribeirinhos usando uma mistura de análise baseada em computador.

Este pipeline de mistura, que utilizou a sequência de DNA COI, levou a maiores evidências de uma delimitação de espécies para besouros do gênero Anisostena, que anteriormente era erguido apenas usando dados morfológicos.

Este protocolo procura abordar o impedimento taxonômico de que a descoberta de espécies por meio da taxonomia baseada em morfologia, que é considerada o padrão-ouro na sistemática de insetos, é muitas vezes demorada e confusa para besouros aquáticos pouco estudados, mas MEGA diversos e altamente discretos.

[Emmanuel] Este pipeline gera hipóteses acessórias moleculares chamadas MOTUs, independentemente de a sequência ter correspondido às espécies conhecidas por sequências referenciadas, ou se as espécies não foram descobertas ou não descritas.

Com isso, em vez de dissecar e comparar centenas de estruturas genitais de besouros de uma só vez, o pipeline fornece agrupamento preliminar no qual os espécimes podem ser examinados quanto à cospecificidade.

[Narrador] Para começar, inicie o MEGA X e carregue as sequências de DNA para alinhamento. Abra a interface de alinhamento selecionando uma linha, clicando em editar ou construir alinhamento e escolhendo criar um novo alinhamento. Clique em OK para confirmar a seleção e selecione DNA como o tipo de dados. Passe o mouse sobre a guia de edição. Clique em inserir sequência do arquivo. Navegue até o diretório apropriado e selecione os arquivos de sequência a serem carregados no MEGA. Agora, clique em alinhamento e, em seguida, selecione alinhar por ClustalW para alinhar as sequências usando as configurações padrão e clique em OK para prosseguir. Para edição manual das sequências, exclua quaisquer inserções clicando nas bases ou posições inseridas e pressionando a tecla delete no teclado. Em seguida, corrija as exclusões clicando no traço que representa uma base ausente, removendo-a e digitando a base pretendida. Em seguida, encontre a posição mais antiga em que todas as sequências contêm um caractere. Clique na caixa em branco no cabeçalho da linha imediatamente à esquerda desta posição e arraste para selecionar todas as posições iniciais em excesso. Pressione delete para cortá-los. Em seguida, encontre a última posição alinhada e clique na caixa à direita deste ponto. Pressione delete novamente para cortar o final. Agora, selecione todas as sequências e clique na guia Sequências de proteínas traduzidas. Quando solicitado, verifique o código genético como mitocôndrial invertebrado. Se o código genético for diferente, clique em não e um menu aparecerá, permitindo marcar a caixa para o código genético mitocondrial de invertebrados. Se os códons de parada marcados com asterisco no alinhamento aparecerem em uma coluna inteira, clique em Sequências de DNA e exclua a primeira posição de todas as sequências. Novamente, clique em Sequências de DNA e salve o alinhamento no formato .mos ou .mosx. Para iniciar a delimitação usando o módulo TaxonDNA, abra o software TaxonDNA. Clique em importar, selecione FASTA e carregue o arquivo de alinhamento no formato FASTA. Agora, clique em módulos e selecione cluster. Defina o valor limite como 3% e marque a caixa rotulada gerar informações individuais em cada cluster. Clique em criar clusters agora para iniciar o clustering e salve os resultados fazendo uma captura de tela. Para delimitação usando o método Kimura 2-Parameter, abra o MEGA e clique no arquivo e, em seguida, selecione abrir um arquivo ou sessão. Clique na distância. Selecione calcular distâncias em pares e confirme o arquivo .meg para delimitação. Passe o mouse sobre a caixa ao lado do modelo ou método e clique na seta para expandir o menu suspenso. Selecione o modelo Kimura de 2 parâmetros e clique em OK para executar o programa. Abra a janela de saída de dados para visualizar os resultados. Clique no arquivo e selecione exportar e imprimir distâncias para salvar o resultado. Abra a espécie de montagem por particionamento automático ou servidor web o mais rápido possível. Clique na caixa laranja rotulada escolha um arquivo e carregue o arquivo .fasta. Role para baixo e clique em ir. Para baixar o resultado do clustering, clique na lista da linha com a pontuação ASAP mais baixa e a classificação de valor P mais alta. Em seguida, para iniciar a estimativa da árvore, abra o MEGA e clique em dados. Em seguida, selecione abrir um arquivo ou sessão para carregar o arquivo .meg. Clique nos modelos e selecione encontrar os melhores modelos de DNA e proteína ou ml para determinar o modelo de substituição mais adequado. Clique em OK no menu de preferências de análise. Agora, para gerar a árvore, clique em filogenia, selecione construir e testar árvore de máxima verossimilhança. Use o modelo de substituição de melhor ajuste clicando na caixa ao lado do modelo ou método e selecionando o modelo apropriado no menu suspenso. Em teste de filogenia, clique na caixa ao lado de teste de filogenia e escolha o método de bootstrap no menu suspenso. Clique na caixa ao lado do número de replicações de bootstrap. Digite 1.000 e clique em OK para executar a análise. Quando a janela que contém a árvore resultante for aberta, salve a sessão como um arquivo .mts ou .mtsx. Salve também a saída como um arquivo .newick e exporte a árvore como uma imagem .png. Para a delimitação baseada em PTP, visite o servidor Web PTP. Clique em escolher arquivo e carregue a árvore no formato Newick. Sob minha árvore está selecionado enraizado. Na caixa em nomes de táxons de grupos externos, insira o grupo externo digitando o nome da dica de táxon. Em seguida, na solução de máxima verossimilhança, clique em baixar resultados de delimitação para salvar a saída PTP ML. Da mesma forma, na solução mais alta com suporte bayesiano, clique em baixar resultados de delimitação para salvar a saída do PTP BI. Para a limitação baseada em MPTP por MPTP, visite o servidor Web MPTP. Carregue o arquivo Newick arrastando-o para o quadrado cinza ou clicando no quadrado. Depois que os dados forem carregados, clique em prosseguir para a seleção do grupo externo. Na página de especificação do grupo externo, selecione o grupo externo clicando na caixa de seleção ao lado dos rótulos dos táxons dos espécimes do grupo externo. Em seguida, clique em seleção de modelo, selecione MPTP e clique em opções de visualização. Na página de opções de visualização, aceite as configurações padrão. Clique em enviar. Clique com o botão direito do mouse nos arquivos em arquivos para download e escolha salvar como para salvar os resultados. Agora, para gerar as unidades taxonômicas operacionais moleculares ou MOTU, abra a árvore usando um programa de edição de fotos ou PowerPoint. Crie uma barra para representar os resultados de cada abordagem de delimitação de espécies moleculares. Se todas as abordagens produzirem resultados idênticos para um determinado cluster molecular, designe o cluster como um MOTU por consenso. Esta figura apresenta a árvore gênica de máxima verossimilhança e os resultados de agrupamento molecular para besouros boranus com base em sequências COI 3-prime e seis métodos de delimitação. Todos os métodos identificaram consistentemente quatro MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A e Byrrhinus B com agrupamento idêntico entre os métodos. Byrrhinus negrosensis e Byrrhinus villarini foram claramente separados, apesar de serem originários dos mesmos locais. Sequências de quatro províncias foram agrupadas em Byrrhinus A, não mostrando forte estruturação geográfica. Esta figura mostra o agrupamento de besouros Anisostena em quatro MOTUS, incluindo Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A e Anisostena B com total concordância entre os métodos. Anisostena auxilium sobrepôs-se geograficamente com Anisostena A e Anisostena B, indicando que a geografia por si só não explicava a divergência molecular.