In vivo Imagem da atividade neural em moscas adultas Drosophila não anestesiadas

Estamos tentando entender a base molecular, celular e de circuito do esquecimento da memória natural, com o objetivo de descobrir como o cérebro apaga ou suprime ativamente as memórias para manter a flexibilidade cognitiva. Pesquisas recentes mostraram que o esquecimento não é apenas uma decadência passiva das memórias, mas sim um processo biológico ativo altamente regulado que requer padrões específicos de atividade neuronal.

Um grande desafio é vincular manipulações de circuitos específicos a processos dinâmicos de memória, integrando dados conectômicos, genéticos e comportamentais de maneira rigorosa e interpretável. Ajudamos a estabelecer que o esquecimento é um processo ativo biologicamente regulado. Nosso trabalho identificou neurônios dopaminérgicos específicos e vias moleculares necessárias para o esquecimento normal no cérebro de Drosophila. Nosso protocolo permite a imagem funcional em moscas sem anestesia, evitando efeitos inespecíficos indesejados pelos anestésicos. Usamos essa abordagem para investigar os correlatos neurais subjacentes à formação da memória e ao esquecimento ativo da memória.

[Narrador] Para começar, use ferramentas Dremel e uma lâmina de serra diamantada para cortar um tubo de metal hipodérmico de calibre 22 com um comprimento de aproximadamente 10 centímetros. Com um disco de corte Dremel 420, lustre ambas as extremidades do tubo para criar uma abertura lisa e limpa que possa acomodar a tromba da mosca. Enrole o tubo cortado em torno de um tubo de centrífuga de 15 mililitros para formar a forma curva desejada. Em seguida, corte um pedaço de 7 centímetros de comprimento de tubo de metal hipodérmico de calibre 12. Agora use uma lâmina de barbear para aparar a extremidade de uma ponta de pipeta de 2 microlitros para encaixar no tubo de metal de calibre 22. Encaixe o tubo de calibre 12 na outra extremidade da ponta da pipeta. Em seguida, misture uma pequena quantidade de resina epóxi e endurecedor. Aplique o epóxi nas junções onde o pequeno tubo de metal encontra a ponta da pipeta e onde o tubo maior se conecta à outra extremidade. Deixe o epóxi curar completamente durante a noite antes de conectar o conjunto a um suporte de micro manipulador e ajustar o ângulo conforme necessário. Para construir uma pipeta de choque e odor, corte 1 mililitro de uma pipeta de vidro 1 x 100 na marca de 3 mililitros usando uma ferramenta diamantada Dremel. Em seguida, corte uma pequena folha de acrílico retangular medindo 24,5 milímetros x 8 milímetros com uma espessura de 1/8 de polegada. Corte uma grade de choque de cobre para caber na peça retangular de acrílico. Solde dois fios elétricos em extremidades opostas da grade de cobre. Agora coloque a grade de cobre na peça de acrílico e dobre-a levemente para acomodar o abdômen e as pernas da mosca. Use fita isolante para prender a grade de cobre à peça de acrílico. Em seguida, use uma pistola de cola quente para prender a pipeta de vidro à grade de choque, garantindo que ela esteja reta e centralizada. Para construir a câmara de gravação, pegue uma lâmina de microscópio de vidro como base da câmara. Misture resina e cola epóxi. Usando a cola epóxi, prenda ímãs de neodímio nos quatro cantos de uma câmara de acrílico preto. Coloque um ímã adicional em cima de cada ímã colado. Em seguida, cole os ímãs recém-colocados em uma lâmina de vidro usando epóxi. Segure o conjunto no lugar com clipes de papel durante a cura. Remova a ponta da pipeta de 200 microlitros do aspirador. Insira o aspirador em um frasco contendo a Drosophila e aspire uma única mosca na ponta da pipeta de 1.000 microlitros. Recoloque a ponta da pipeta de 200 microlitros de volta no aspirador. Em seguida, sopre suavemente e sacuda o aspirador para que a mosca fique imobilizada de cabeça na parte superior da ponta da pipeta de 200 microlitros. Em seguida, coloque a câmara de dissecção no suporte do manipulador. Conecte o vácuo ao tubo de retenção de moscas e ajuste a vazão para aproximadamente 500 mililitros por minuto. Agora mova o tubo de metal a vácuo para o centro do campo de visão do microscópio. Aspire suavemente a tromba das moscas no suporte do vácuo. Ajuste o manipulador para alinhar a cabeça da mosca com a abertura da câmara. Ligue a fonte de alimentação de corrente contínua. Usando fio de resistência de platina, aplique ácido mirístico derretido para colar os olhos e o tórax na câmara. Uma vez fixado, desconecte o tubo de vácuo. Remova a câmara de gravação da conexão de vácuo usando o manipulador e vire a câmara de cabeça para baixo. Em seguida, cole a tromba por baixo usando resistência de platina. Quando tudo estiver colado, desligue a fonte de alimentação de corrente contínua. Em seguida, vire a câmara na vertical. Fixe a câmara à base da lâmina de vidro. Corte um pequeno pedaço de fita adesiva com uma tesoura e coloque-o na frente e atrás da cabeça da mosca. Gire a câmara de modo que a cabeça da mosca fique voltada para o experimentador em um ângulo de 90 graus. Com uma agulha de dissecação, faça incisões verticais ao longo das laterais dos olhos. Gire a câmara horizontalmente. Em seguida, faça um corte horizontal na cutícula. Agora adicione 100 microlitros de solução salina no topo da cabeça da mosca. Usando uma pinça afiada, remova a janela da cutícula e, em seguida, remova qualquer gordura ou traqueia restante com a pinça. Coloque uma mosca preparada no microscópio stage de um microscópio confocal equipado com um laser e uma objetiva de imersão em água. Com um micro manipulador, ajuste a posição da grade de choque e da pipeta de odor para que a mosca seja posicionada corretamente na grade de choque. Use o botão de ajuste z do curso para escanear o eixo z do cérebro e localizar a região cerebral de interesse. Defina o tamanho do quadro para 512 x 512 pixels. Comece a gravar a partir do neurônio de interesse usando um sistema de entrega de odor personalizado ou disponível comercialmente. Defina a duração da gravação para 2 minutos. Inicie o protocolo de treinamento usando o sistema de entrega de odor 5 minutos após coletar as respostas pré-treinamento. Em seguida, registre as respostas pós-treino cerca de 5 a 15 minutos após o treino. O indicador de cálcio GCaMP6f e a proteína fluorescente vermelha tdTomato foram expressos seletivamente no neurônio de saída do corpo do cogumelo com dendritos projetando-se nos lobos gama e alfa do corpo do cogumelo, e o neurônio foi visualizado usando a linha de driver MB077C split-GAL4. As respostas de cálcio no neurônio de saída do corpo do cogumelo ao 3-octanol foram significativamente reduzidas 5 minutos após o condicionamento reversivo sem anestesia e permaneceram suprimidas em 15 minutos. Em contraste, as respostas de cálcio ao 4-metilciclohexanol foram significativamente aumentadas 5 minutos após o treinamento e permaneceram elevadas em 15 minutos. Imagens pseudocoloridas demonstraram alterações de fluorescência distintas antes e depois do treinamento. Em moscas anestesiadas, as respostas de cálcio pós-treinamento ao CS+ foram apenas parcialmente reduzidas e as respostas ao CS- não foram significativamente diferentes da linha de base. A análise quantitativa confirmou que a resposta CS+ foi significativamente deprimida após o treinamento em moscas anestesiadas, mas as respostas CS- permaneceram estatisticamente inalteradas. A plasticidade foi significativamente maior nas moscas não anestesiadas em comparação com as anestesiadas.