Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática: Uma Ferramenta Reutilizável Impressa em 3D para Microscopia Intravital Hepática

O objetivo geral deste procedimento é apresentar a Ferramenta de Imagem Hepática Reutilizável, ou RHIT, como uma ferramenta inovadora para capturar dados biológicos dinâmicos e de alta qualidade, especialmente em pesquisa hepática. Métodos científicos tradicionais para estudar camundongos em experimentos controlados há muito tempo se baseam na observação comportamental, monitoramento fisiológico e análise genética. A complexidade desses estudos frequentemente resulta em resultados de dados inconsistentes ou limitados.

Muitos experimentos dependem de dados que são incompletos ou difíceis de interpretar, como breves flashes de imagens de baixa resolução que rapidamente desaparecem, dificultando a captura de tendências de longo prazo ou mudanças sutis. Introduzindo o RHIT, possibilitando captura dinâmica e de alta resolução para pesquisas hepáticas e além. A técnica que demonstramos permite a fabricação de ferramentas de imagem personalizadas usando materiais acessíveis e tecnologia de impressão 3D amplamente disponível.

Projetada para uso em ambientes acadêmicos e com recursos limitados, essa abordagem permite o desenvolvimento e implantação rápida de dispositivos para suportar imagens in vivo de alta resolução. Nossa Ferramenta de Imagem Hepática Reutilizável, ou RHIT, foi desenvolvida para melhorar a estabilidade dos tecidos durante a microscopia intravital do fígado. O design modular do RHIT acomoda camundongos de vários tamanhos e suporta imagens estendidas de processos metabólicos dinâmicos com perturbações fisiológicas mínimas.

O RHIT é fabricado em uma única etapa usando acrilonitrila, butadieno, estireno, ABS, um termoplástico selecionado por seu peso leve, termostabilidade e durabilidade mecânica. Ao ajustar a densidade do material, o RHIT absorve efetivamente o movimento causado pela respiração e pelo batimento cardíaco, reduzindo assim artefatos de imagem e aumentando a clareza. A inércia química e a insolubilidade em água do ABS garantem a disponibilidade com tecido biológico e permitem limpeza e reutilização eficientes.

Para recriar o RHIT, use um software de design de produto 3D. O Autodesk Inventor foi usado para esse projeto. Abra o Autodesk Inventor e crie uma nova peça padrão.

Salve o arquivo com a descrição apropriada. Crie o esboço do RHIT no plano frontal usando o recurso de criar esboço 2D. Clique no ícone retangular e coloque seu canto inferior esquerdo na origem do plano de esboço.

Desenhe um segundo retângulo dentro do primeiro para representar a janela de imagem do RHIT. Adicione dimensões a ambos os retângulos usando a característica de dimensões, garantindo que todos os comprimentos e larguras sejam referenciados à origem e relativos entre si. Ajuste as dimensões do RHIT de acordo com o tamanho do mouse.

Adicione espessura ao RHIT selecionando apenas o retângulo externo e extrada o esboço usando a ferramenta extrudor para deixar uma abertura no centro. Selecione a face inferior do RHIT extrudado e comece um novo esboço 2D usando o recurso de iniciar esboço 2D. Desenhe um retângulo para definir o bolso da almofada térmica.

Defina as dimensões do retângulo com base no tamanho e espessura da almofada térmica que será inserida nessa ranhura. Essas medições devem corresponder à almofada térmica física a ser usada para garantir uma modelagem precisa da temperatura do mamífero. Aplique as dimensões exigidas usando a característica de dimensão.

Saia do esboço 2D e realize uma remoção de material usando a ferramenta de extrusão cortada para criar uma cavidade profunda para a almofada térmica. Dê zoom conforme necessário para posicionar o esboço com precisão. Comece um novo esboço para a sonda de temperatura na mesma face da cavidade.

Clique em iniciar um esboço 2D e selecione o ícone do círculo. Coloque o círculo na superfície lisa e dimensione de acordo. Saia do modo esboço.

Clique em extrudar e selecione o esboço do círculo. No modo extrusão, clique em cortar, extrudir e remover material. Coloque o círculo no lado direito da face com o inserto de bolso.

Ainda não precisa estar centralizado. Adicione dimensões para alinhá-lo com o centro da espessura do RHIT. Clique em extrudar.

Um pop-up aparecerá com uma seta mostrando a direção do corte, junto com a opção de atravessar tudo. Selecione por todos para cortar todo o material, depois clique em ok. Sair do modo extrusão.

Adicione filetes nas bordas da janela clicando no ícone de filete e selecione todas as oito bordas afiadas. Adicione o tamanho do filete e saia do modo filete. Prepare o modelo para impressão 3D navegando até a aba ambiente e selecionando a aba de impressão 3D.

Para imprimir o RHIT não modificado, importe o arquivo STL, seja da figura 1A ou dos materiais suplementares, para o software de preparação para impressão 3D A. Clique em importar, selecione o arquivo e clique em preparar para cortar o modelo em camadas imprimíveis. Escolha uma impressora 3D comercial compatível e clique em imprimir.

Monitore o processo de impressão. Quando estiver pronto, remova e limpe cuidadosamente o RHIT impresso conforme necessário. Espere de 10 a 15 minutos após as ejeções antes de começar a cirurgia e a imagem.

Preparação para microscópio e uso do RHIT. Prepare um microscópio confocal invertido convencional para IBN hepático, como mostrado na figura 2A. Insira o adaptador de palco para acomodar a amostra.

Para esse protocolo, foi usado um inserto metálico personalizado com abertura circular de 35 milímetros e vidro de cobertura de 40 milímetros. Limpe cuidadosamente ambos os lados do vidro da tampa antes e depois da imagem, usando etanol a 70% conforme necessário. Fixe o RHIT apropriado com base no tamanho do mouse com fita, alinhando a abertura RHIT com a lente objetiva, paralela ao deslize de cobertura de imagem, como mostrado na figura 2G, no inserto metálico com fita sobre o vidro da cobertura.

Selecione o objetivo para imagem com base no tamanho da área, resolução espacial e tempo de imagem, como um objetivo de água 25X por 95. Nivele o objetivo perto do vidro da cobertura. Prenda uma tira de gaze na janela molhada com fita.

Isso ajuda a posicionar o tecido e separá-lo de outros órgãos abdominais. Pré-aqueça o RHIT usando uma almofada térmica inserida na ranhura e fixe a sonda térmica adjacente ao RHIT, mostrado na figura 2G até H. Isso manterá a temperatura corporal do mouse durante a imagem. Raspe o pelo abdominal usando um aparador e/ou creme depilador.

Remova resíduos de cabelo e desinfete a pele exposta com 70% de etanol. Dependendo dos requisitos institucionais da IACUC, pode ser usada uma aplicação alternada de Betadine e etanol para garantir a preparação adequada do local cirúrgico. Reavalie a profundidade da anestesia antes da cirurgia no animal.

Expor o fígado fazendo uma incisão horizontal em forma de crescente de dois a três centímetros sob a caixa torácica com tesouras cirúrgicas a partir do xifóide, terminando no lado lateral esquerdo do abdômen superior. Após a incisão inicial, faça cuidadosamente uma incisão secundária menor na camada muscular para expor o lobo esquerdo do fígado. Cauterize conforme necessário para evitar sangramento.

Evite danos ao fígado durante o uso do cauterizador, colocando uma gaze embebida em soro fisiológico entre o fígado e a camada muscular para absorver o calor emanado do músculo. Evite qualquer sangramento excessivo, trauma cirúrgico ou mecânico, ou compressão externa. Uma vez exposto o fígado, transfira o camundongo para o estágio do microscópio.

Posicionamento do rato no palco do microscópio. Posicione o abdômen do rato anestesiado voltado para baixo sobre a plataforma RHIT do microscópio. Ajuste o cone do nariz para que o camundongo permaneça sob anestesia.

Use um aplicador com ponta de algodão embebido em soro fisiológico para guiar suavemente o lobo lateral esquerdo do fígado contra a capa de cobertura enquanto aplica pressão externa suavemente na cavidade torácica. Aproveite a gravidade para manobrar cuidadosamente o fígado para fora e sobre o vidro da cobertura. Use uma tira de gaze para separar suavemente o fígado do corpo do rato.

Verifique novamente o cone do nariz para garantir que o camundongo permaneça sob anestesia durante a imagem. Previna a desidratação dos tecidos aplicando um gel à base de água ao redor das bordas da cavidade exposta e evitando contato direto com a almofada térmica. Um microscópio com câmara de umidade fechada também pode ajudar a manter a temperatura e a umidade.

Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Por fim, configure a IVM em timelapse para começar a fazer exames de imagem. Abra as persianas do laser, avalie a marcação fluorescente e identifique uma região estável de interesse com fluxo sanguíneo notável.

Selecione as aquisições de imagem apropriadas, incluindo formato, velocidade, intervalos de imagem, duração do tempo, média de quadros, etc. Defina limites superiores e inferiores para os Z-stacks, se necessário, e inicie a gravação em timelapse. Para validar nosso protocolo, quantificamos a estabilidade da imagem usando o índice de similaridade estrutural, ou SIM, mostrado na figura 3D.

O SIM compara duas imagens com base em luminância, contraste e padrões estruturais. Um valor de um indica similaridade perfeita, enquanto zero reflete distorção. A Figura 3C mostra que o RHIT consistentemente gera os maiores valores de SIM, até 50 vezes maiores do que nenhum insert, demonstrando qualidade de imagem superior.

Em imagens rotuladas de A a C, comparamos a IVM hepática sem estabilizador, com o papelão inserido, e com RHIT. A RHIT mantém resolução clara das gotículas lipídicas no magenta, núcleos no verde e vasculatura no ciano. Inserções em preto e branco destacam a estabilidade da imagem.

O RHIT também possibilitou o IBM de longo prazo em camundongos obesos por mais de oito horas, como mostrado no primeiro filme. Juntos, esses resultados confirmaram que o RHIT melhora significativamente a qualidade e a reprodutibilidade das imagens em todas as condições. Em conjunto, o RHIT simplifica a configuração complexa tradicionalmente exigida para o IBM hepático, melhorando tanto a reprodutibilidade quanto a acessibilidade.

Essa abordagem antecipa um movimento mais amplo para o uso da impressão 3D para a padronização de protocolos avançados de imagem. Além da imagem hepática, os princípios de design do RHIT podem ser estendidos a outras aplicações, incluindo tomografia de órgãos, ciência dos materiais e engenharia, onde a estabilidade do movimento é fundamental para a fidelidade da imagem.