Usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes

Nosso objetivo é microrrobôs semelhantes a células que navegam pelos tecidos do corpo para administrar terapias localmente. Eles são baseados em vesículas unilamelares gigantes e uma membrana fosfolipídica e contêm partículas ativas. Este protocolo oferece um guia para iniciantes que desejam adotar e adaptar o método de transferência de gotículas em biologia sintética e em outros campos, por exemplo, em microrrobótica.

Comparado a outras técnicas de preparação de GUV, este protocolo oferece alta eficiência de encapsulamento e execução direta, tornando-o acessível a qualquer grupo de pesquisa com equipamentos básicos de laboratório. Avaliaremos a navegação de microrrobôs baseados em GUV em ambientes semelhantes a tecidos e implementaremos estratégias de detecção para permitir o movimento autônomo em direção às células doentes. Para começar, mova a câmara das luvas para dentro ou ao lado de uma capa química.

Abra a câmara da luva e coloque um cristalizador cheio de partículas de sílica no fundo da câmara. Cubra o cristalizador com uma superfície de suporte branca e, em seguida, coloque-o em camadas com toalhas de papel. Insira todos os materiais necessários na câmara das luvas e coloque o frasco de vidro contendo a solução de clorofórmio em um suporte de anel de cortiça ou um copo de 150 mililitros posicionado o mais próximo possível do lado do operador.

Agora, feche o compartimento das luvas, certificando-se de que as duas metades estejam alinhadas com segurança e não possam deslizar. Use os parafusos de plástico fornecidos para vedar completamente a câmara. Feche a válvula de saída e mergulhe o tubo número cinco em um copo de 500 mililitros cheio de água até a metade.

Em seguida, conecte a extremidade regulada pela válvula do tubo número dois à linha de vácuo. Em seguida, conecte a outra extremidade à linha de nitrogênio usando o tubo número três. Abra a válvula e ligue a linha de vácuo até que as luvas inflem, e fiquem muito rígidas para dobrar.

Em seguida, feche a linha de vácuo e a válvula. Em seguida, abra a linha de nitrogênio até que as luvas esvaziem e se estendam para fora da câmara das luvas. Depois de colocar as luvas, use uma seringa Hamilton para transferir o volume especificado de DOPC em solução de clorofórmio para um frasco de vidro escuro.

Feche o frasco para injetáveis com a tampa que contém as agulhas. Agora, conecte o tubo número seis ao tubo número oito e o tubo número sete ao tubo número nove usando as junções bidirecionais. Remova as luvas do compartimento das luvas e abra a válvula de saída.

Em seguida, abra lentamente a linha de nitrogênio e monitore o fluxo de gás para ver se há bolhas no béquer. Aumente gradualmente o fluxo de nitrogênio até que uma taxa de borbulhamento constante, mas observável, seja alcançada. Após três minutos de fluxo, feche a linha de nitrogênio.

Assim que a bolha final sair do béquer, feche a válvula de saída. Coloque as luvas de volta e desconecte os tubos oito e nove das junções bidirecionais. Em seguida, abra o frasco e mova a tampa de volta para o tubo de 50 mililitros.

Em seguida, abra o frasco de óleo e transfira a quantidade necessária de óleo para o frasco escuro. Feche o frasco com a tampa novamente, remova as luvas e abra o compartimento das luvas. Vortex vigorosamente o frasco para injetáveis de suspensão lipídica selada por pelo menos 30 segundos.

Em seguida, incube-o a 80 graus Celsius em banho-maria por 30 minutos. Depois de agitar o frasco novamente, incube-o durante a noite em temperatura ambiente. Usando uma tesoura, corte a tampa de um tubo de cinco mililitros.

Faça um furo de aproximadamente oito milímetros no centro da tampa para encaixar uma ponta de pipeta P1000. Se o orifício for muito largo para caber na ponta, descarte a tampa e reinicie com uma nova. Com uma tira de lixa de dois por cinco centímetros, alise as bordas do furo.

Coloque a tampa de volta no tubo de cinco mililitros e centrifugue a 3.000g por cinco minutos para eliminar quaisquer partículas plásticas residuais. Em seguida, remova a tampa e descarte o tubo. Agora, corte a tampa de um novo tubo de cinco mililitros e substitua-a pela tampa furada preparada.

Insira uma ponta P1000 através do orifício com um O-ring travado entre a ponta e a tampa para evitar mais movimentos para baixo. Encha o tubo com 5,5 mililitros de solução externa através da ponta. Vortex o frasco para injetáveis de suspensão lipídica preparado anteriormente por pelo menos 30 segundos.

Em seguida, incube-o no banho-maria a 50 graus Celsius por 30 minutos. Deixe as soluções de água preparadas anteriormente se equilibrarem à temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Agora, pipete 300 microlitros de solução externa em um tubo de 1,5 mililitro ou no tubo de cinco mililitros modificado anteriormente.

Camada lenta de 100 microlitros de suspensão lipídica sobre a solução oleosa, garantindo a formação de duas fases distintas e contínuas. Deixe a interface descansar sem ser perturbada por 10 minutos para se equilibrar. Em um tubo de dois mililitros, pipete 250 microlitros de suspensão lipídica, seguidos por 6,25 microlitros de solução interna para preparar uma emulsão a 2,5% de água em óleo.

Misturar as duas fases até que a emulsão fique homogénea e estável. Transfira 200 microlitros da emulsão preparada para a interface de suspensão lipídica da solução oleosa formada anteriormente. Se estiver usando um tubo de 1,5 mililitro, basta fechar o tubo.

Se estiver usando o tubo de cinco mililitros modificado, coloque uma tampa de borracha na ponta da pipeta e transfira suavemente todo o tubo para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue os tubos à temperatura ambiente na velocidade apropriada. Após a centrifugação, verifique se um pellet opaco está presente na parte inferior e se a fase oleosa está clara na parte superior.

Para remover o óleo do tubo de cinco mililitros contendo GUVs, recupere a ponta da pipeta do tubo, garantindo que a tampa de borracha permaneça no lugar. Descarte a ponta e guarde a tampa de borracha, o anel de vedação e a tampa de retenção para uso futuro. Em vez disso, se estiver usando um tubo de 1,5 mililitro, use uma micropipeta P1000 para remover a solução de óleo, deixando para trás aproximadamente 50 microlitros e certificando-se de não perturbar o pellet.

Troque a ponta da pipeta e ressuspenda o pellet nos 50 microlitros restantes da solução. Finalmente, transfira o material ressuspenso para um tubo limpo de dois mililitros. As soluções lipídicas preparadas em condições de alta umidade produziram vesículas unilamelares gigantes com rendimentos significativamente menores e maior prevalência de agregados desordenados em comparação com aquelas preparadas em câmara com umidade controlada, embora alguns agregados ainda estivessem presentes nesta última.

A 3.300g por 20 minutos, o rendimento e a qualidade das vesículas carregadas de sacarose foram ótimos, enquanto as velocidades de centrifugação mais baixas e mais altas permitiram resultados desfavoráveis, como rendimento reduzido ou formação de agregados. O óleo mineral resultou em vesículas com maior distribuição de diâmetro médio, enquanto o óleo de silicone AR 20 gerou uma contagem geral de vesículas significativamente maior.