Name: Usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a preparar vesículas unilamelares gigantes pelo método de transferência de gotículas com alta eficiência de encapsulamento. Este protocolo acessível possibilita aplicações em biologia sintética e microrrobótica para terapia localizada.

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<li>Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. <a target="_blank" href="https://www.taylorfrancis.com/chapters/edit/10.1201/9781315152516-1/preparation-methods-giant-unilamellar-vesicles-rumiana-dimova-pasquale-stano-carlos-marques-peter-walde?context=ubx&refId=bca4cc2f-16fd-4222-8c37-3bacb6c1e469">Preparation methods for giant unilamellar vesicles.</a> Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).</li>
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Implementando uma técnica previamente descrita para a produção de lipossomas1, Pautot et al. estabeleceram um protocolo para a produção de vesículas lipídicas com diâmetros variando de 0,1 a 1 μm de diâmetro2. O método de transferência de gotículas tem se mostrado rapidamente eficaz na produção de vesículas ainda maiores (diâmetros superiores a 1 μm)3, ganhando cada vez mais popularidade pela simplicidade de execução e pela alta eficiência de encapsulamento. De fato, em comparação com os métodos de inchaço (como inchaço em gel ou eletroformação), este protocolo reduz o volume de solução de carga necessária para formar um número comparável de vesículas e os resíduos associados4. Os GUVs podem ser montados a partir de interfaces de fluidos por meio de métodos alternativos com eficiência de encapsulamento comparável. No entanto, quando comparada àquelas baseadas em chips microfluídicos 5,6 ou encapsulamento contínuo de cruzamento de interface de gotículas (cDICE)7, a transferência de gotículas oferece a configuração mais simples acessível em qualquer laboratório com equipamento básico. Além disso, os métodos microfluídicos podem levar a GUVs com inclusões de óleo indesejadas na membrana. Por essas razões, a transferência de gotículas tem sido o método de escolha para carregar GUVs com cargas valiosas nos campos de células artificiais 3,8,9,10 e, recentemente, microrrobótica 11,12.
O método baseia-se na formação de folíolos de membranas através da estabilização de interfaces água/óleo mediadas por fosfolipídios. Primeiro, os fosfolipídios são dissolvidos em um óleo (solução lipídica, LS), depois uma emulsão de água em óleo é preparada com a solução aquosa contendo a carga GUV desejada (solução interna, IS) no LS oleoso. A emulsão é então transferida para um tubo onde outra solução aquosa (chamada solução externa, OS) foi previamente equilibrada com LS para formar uma interface água-óleo. Os GUVs são formados quando as gotículas de água são forçadas a atravessar essa interface OS / LS por centrifugação: o folheto interno dos GUVs é formado na superfície das gotículas IS, enquanto o folheto externo é formado entre OS e LS (Figura 1).
Muitas variantes de protocolo foram descritas com parâmetros ajustados de acordo com as necessidades experimentais contingentes. Uma primeira tentativa extensa de otimizar o processo foi descrita por Moga et al.13, enquanto Zhang et al. reuniram a maioria dos exemplos relevantes em uma revisãorecente14. Apesar dos muitos parâmetros descritos que influenciam o protocolo, não há indicação de como um processo de otimização poderia ser conduzido para uma nova formulação de GUV, nem as melhores práticas para recuperação e manipulação de GUV após a produção. Com base na literatura científica disponível e em nossa experiência direta, fornecemos aqui um protocolo geral para produzir GUVs enquanto discutimos os princípios básicos. Ao fazer isso, fornecemos indicações úteis para a otimização de novas formulações de GUV e duas precauções sempre aplicáveis ao protocolo: a preparação de LS em um ambiente controlado e um método para remover facilmente a fase oleosa superior para a recuperação de uma amostra GUV limpa. Escolhemos dois exemplos: um com sacarose 240 mM como IS e DOPC 0,2 mM em óleo de silicone AR20 como LS (condição E [vazio], ver Tabela 1) e outro composto por micropartículas de poliestireno a 0,2% de 1,1 μm em sacarose 240 mM como IS e DOPC de 3,18 mM em óleo mineral como LS (condição P [com partículas], ver Tabela 1). Ambas as amostras foram produzidas com 240 mM de glicose como OS. Escolhemos essa osmolaridade para obter GUVs que, em condições fisiológicas, possuem uma membrana lipídica relaxada (baixa tensão de membrana).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Representação esquemática do método de transferência de gotículas. (A) Três soluções são preparadas em frascos separados: fosfolipídios em óleo (fase amarela) para formar uma solução lipídica, uma solução contendo sacarose (em ciano) como solução interna e uma solução de glicose equiosmolar (branca) como solução externa. (B) LS é então misturado com o IS para formar uma emulsão estável, então (C) uma interface entre OS e LS é permitida para equilibrar antes (D) a emulsão é derramada em cima dela. (E) As gotículas de água são forçadas a atravessar a interface LS / OS por força centrífuga para (F) permitir a formação de GUVs. A figura não está em escala e destina-se a fornecer apenas um esquema do método. Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; membrana de ésteres de celulose mista m filtros de seringa</td><td>Merck</td><td>SLGSVR255F</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Bioclasse</td><td>06.0279.00</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L seringa de vidro</td><td>Merck</td><td>20737</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 150 mL</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>213-1123</td><td>Pelo menos 3</td></tr><tr><td>Frascos de vidro escuro de 20 mL ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-9001A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 2 mL</td><td>Bioclasse</td><td>07.3534.99</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de 50 mL</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>612-3843</td><td></td></tr><tr><td>500 &mu; L seringa de vidro</td><td>Hamilton</td><td>549-1166</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>Merck</td><td>CLS352070</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 50 mL&nbsp;</td><td>Fisher Científico</td><td>8SS50L1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>622201</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 600 mL</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>213-1126</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; Chner Frasco</td><td>Merck</td><td>Z740682</td><td></td></tr><tr><td>Anéis de cortiça para frascos de fundo redondo</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>217-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cristalizador</td><td>Dutscher</td><td>080474A</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Termo-higrômetro digital</td><td>Bohlender</td><td>V1863-07</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Pesquisa Avanti</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de erioglaucina (Azul Brilhante FCF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa G18</td><td>Terumo</td><td>AN1838R1</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa G21</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de luvas</td><td>Bel-Art</td><td>Rolamento F50030-0000</td><td>Se disponível, um porta-luvas pode ser usado, mas em laboratórios com baixos níveis de umidade pode não ser necessário</td></tr><tr><td>Agitador magnético de placa quente</td><td>Material de laboratório LLG</td><td>6.263 448</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral leve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>Nova coccina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199737</td><td></td></tr><tr><td>O-Ring de borracha nitrílica O-Ring O-Ring, furo de 8 mm, diâmetro externo de 12 mm</td><td>RS</td><td>196-4863</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de rosca abertas com septo ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-0031A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta P1000</td><td>Fisher Científico</td><td>12346132</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta P10000</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>89079-978</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta P200</td><td>Fisher Científico</td><td>12326132</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>KIMB6657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (1000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000919</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (10000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000765</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000870</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de poliestireno, 1,1 &micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LB11-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de borracha</td><td>Bioclasse S.r.l.</td><td>12.2300.05</td><td></td></tr><tr><td>Junta cônica de borracha</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>217-0211</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de parafuso&nbsp; ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-0161A</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de silicone AR20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone (diâmetro interno 1,6 mm, diâmetro externo 3 mm)</td><td>RS</td><td>667-8441</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone (diâmetro interno 6 mm, diâmetro externo 12 mm)</td><td>RS</td><td>273-2541</td><td>Pelo menos 6 m</td></tr><tr><td>Junção de três vias</td><td>RS</td><td>795-405</td><td></td></tr><tr><td>Junção bidirecional</td><td>RS</td><td>419-7287</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de duas vias</td><td>Claber</td><td>91280</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22934</td><td>Quando disponível, este produto pode ser substituído por água purificada através de sistemas Milli-Q</td></tr><tr><td>Tesoura Universal</td><td>Bochem</td><td>4154</td><td></td></tr></tbody></table>

usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes

Using the Droplet Transfer Method to Reliably Prepare Giant Unilamellar Vesicles

Uma preparação ideal de GUV é caracterizada pela formação de uma fase oleosa clara e um pellet distinto ( Figura 4A ). Nos casos em que as gotículas de água não se convertem em GUVs, elas normalmente colapsam e deixam detritos fosfolipídicos na interface OS / LS ( Figura 4C ). Este efeito é provavelmente causado pela agregação de fosfolipídios e outras moléculas da fase oleosa, resultante do equilíbrio insuficiente de fosfolipídios na interface água/óleo. No entanto, apesar da ausência de um pellet visível ou da presença de detritos na interface, os GUVs ainda podem se formar, permitindo que o processo continue. Embora as etapas de lavagem não sejam totalmente eficazes na remoção de todos os detritos fosfolipídicos, elas ajudam significativamente na eliminação de gotículas de óleo, melhorando a qualidade geral da amostra (compare a Figura 6A e a Figura 6B).
O uso de LS antigo ou LS preparado em condições de alta umidade geralmente resulta em dispersões GUV reduzidas com menor rendimento e maior teor de agregados desordenados que são provavelmente formados por fosfolipídios e outras moléculas da fase oleosa (Figura 6C). Para LS preparado em condições de alta umidade, observamos coeficientes de variação acima de 0,8 na produção de GUV (com amostras contendo muito poucos GUVs), enquanto para LS preparado na câmara de luva modificada, o coeficiente de variação foi inferior a 0,5.
Diferentes condições de centrifugação podem afetar o rendimento e a qualidade do GUV. A partir de uma análise qualitativa, 20 min a 3.300 × g foi identificado como uma boa condição para GUVs carregados com sacarose (amostra E). A redução da velocidade (45 min a 500 × g) resultou em uma redução do rendimento, enquanto um aumento (5 min a 16.600 × g) levou a uma maior formação de agregados fosfolipídicos desordenados. Uma força centrífuga fraca pode impedir que muitas gotículas cruzem a interface OS / LS, daí o rendimento reduzido, enquanto uma força forte pode não fornecer tempo suficiente para a organização dos fosfolipídios no folheto externo durante o cruzamento da interface (Figura 7). O encapsulamento de micropartículas também pode ser otimizado com ajustes nos parâmetros de centrifugação, desde que a densidade de massa das micropartículas corresponda aproximadamente à do IS. Para isso, diminuir a aceleração de centrifugação (e, por sua vez, aumentar o tempo de centrifugação) permite uma encapsulação mais homogênea das partículas, evitando a quebra da membrana fosfolipídica devido à força exercida pelas partículas sólidas (um exemplo de boa encapsulação é mostrado na Figura 6D enquanto a investigação dos parâmetros ideais de centrifugação ainda está em andamento17).
Como a difusão de fosfolipídios pode ser afetada pela fase oleosa, um teste qualitativo simples pode ser executado para avaliar a estabilidade da emulsão (Figura 5). Com a ajuda de um corante corante (Brilliant Blue FCF) dissolvido no IS para melhorar a visualização, emulsões com diferentes proporções de água/óleo podem ser preparadas e observadas ao longo do tempo. A perda de estabilidade pode ser visualizada pela agregação de gotículas de água e a consequente separação da fase oleosa. Como gotículas grandes (visíveis a olho nu) têm menos probabilidade de serem convertidas em GUVs, recomendamos o uso da condição de emulsão que fornece a menor separação de fases.
O efeito das variações no protocolo pode ser verificado por meio de uma análise de distribuição de tamanho, conforme descrito na seção 4 do protocolo: os diâmetros dos GUVs podem ser medidos usando ImageJ a partir de imagens de microscópio de contraste de fase e a distribuição de tamanho pode ser analisada com um script disponível no GitHub16. Seguindo esse protocolo, foi possível, por exemplo, observar um aumento de GUVs com diâmetros maiores quando o óleo mineral é escolhido em vez do óleo de silicone AR20 (Figura 8).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Configuração da câmara da luva. Esta figura mostra as principais modificações na câmara de luvas para a preparação da solução lipídica. (A) Conexão de entrada com nitrogênio e vácuo; (B) conexão de entrada com a câmara de luvas; (C) válvula de saída; (D) tampa com agulhas para evaporação do solvente; (E) tubos finos para evaporação de solventes; (F) partículas de sílica para absorver umidade; (G) itens a serem colocados na câmara das luvas: termo-higrômetro digital (1), solução lipídica em solvente orgânico (2), porta-anel de cortiça (3), seringa de vidro (4), tampa aberta com septo e agulhas (5), solução de óleo (6), frasco escuro aberto com tampa (7), ponteiras de 10 mL (8), pipeta P10000 (9); (H) extremidade do tubo de saída mergulhada em água; (I) frasco fechado com tampa com agulhas conectada à entrada e saída; (J) esquemas da câmara de luvas modificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig3v5.jpg"> 
Figura 3: Recipiente para fácil remoção de óleo. Principais etapas na preparação de GUVs em um recipiente para facilitar a remoção do óleo de acordo com a seção 2.1 do protocolo. (A) Um orifício é feito em uma tampa de tubo de 5 mL para permitir que uma ponta P1000 se encaixe; então (B) a tampa é colocada em um tubo vazio de 5 mL com a ponta inserida no orifício através de um O-ring. (C) As soluções são colocadas no tubo de acordo com as seções 2.2 e 2.3 do protocolo, a ponta é tampada e o tubo é colocado dentro de um tubo de 50 mL. GUVs preparados a partir de DOPC 0,2 mM em óleo de silicone foram carregados com sacarose 230,7 mM e 3,1 mM Brilliant Blue FCF para melhorar a visualização. (D) Após a centrifugação, a fase oleosa superior fica presa dentro da ponta junto com uma parte do tampão GUV (que aparece ciano devido a parte das gotículas não se converter em GUVs e liberar o corante no OS). Graças à tampa de borracha, a ponta pode ser facilmente removida do tubo de 5 mL junto com o conteúdo líquido, permitindo assim uma remoção rápida e fácil de toda a fase oleosa. (E) O pellet GUV pode ser facilmente coletado do fundo de um tubo em uma dispersão clara, sem contaminação aparente por óleo, conforme verificado (F) por microscopia de contraste de fase. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig4v5.jpg"> 
Figura 4: Formação de GUV. Exemplos de (A) interface OS/LS, (B) um pellet GUV limpo com uma fase oleosa clara e (C) um pellet GUV com detritos na interface OS/LS (os detritos e o pellet parecem avermelhados porque o IS desta população GUV foi suplementado com 1,65 mM de corante New Coccine para melhorar a visualização). Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig6v5.jpg"> 
Figura 5: Estabilidade da emulsão com diferentes proporções de óleo e água em óleo. A figura mostra a estabilidade das emulsões ao longo do tempo, dependendo do tipo de óleo e da relação água/óleo (a/o) utilizada. O IS foi composto por 230,7 mM de sacarose e 3,1 mM de Bright Blue FCF para melhorar a visualização das emulsões. As emulsões preparadas com óleo mineral são menos estáveis do que suas contrapartes feitas com óleo de silicone AR20. Este efeito é ainda mais amplificado com o aumento das proporções sem fio. Embora as emulsões no óleo de silicone AR20 sejam significativamente mais estáveis, sua estabilidade também diminui à medida que a relação a/o aumenta, com separação de fases visível imediatamente após a emulsificação (óleo de silicone AR20 a 10%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig5v5.jpg"> 
Figura 6: Observação de GUVs com um microscópio de contraste de fase. Uma ampliação de 20x de GUVs carregados com sacarose preparados a partir de um LS composto de 3,18 mM DOPC em óleo mineral. (A) Amostra recuperada após a remoção do óleo; (B) amostra recuperada após as etapas de lavagem; (C) baixo rendimento de GUV obtido de um LS preparado em ambientes com oxigênio e umidade não regulados; (D) GUVs carregados com micropartículas. Barra de escala = 10 μm; gotas de óleo são circuladas e exemplos de agregados desordenados de fosfolipídios e moléculas de óleo são indicados por uma seta. Abreviaturas: LS = solução lipídica; GUVs = vesículas unilamelares gigantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig7v5.jpg"> 
Figura 7: Efeito de diferentes condições de centrifugação na formação de GUV. Imagens de contraste de fase de GUVs carregados com sacarose preparados com um LS composto de 0,2 mM DOPC em óleo de silicone AR20. A figura mostra uma comparação qualitativa de GUVs em (A) 16.600 × g por 5 min, (B) 3.300 × g por 20 min e (C) 500 × g por 45 min. Enquanto a alta velocidade de centrifugação resulta em uma maior presença de agregados de fosfolipídios, a baixa velocidade de centrifugação leva à redução do rendimento. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: LS = solução lipídica; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig8v5.jpg"> 
Figura 8: Análise da distribuição de tamanhos. Comparação de duas amostras de GUV carregadas com sacarose obtidas de (A) 0,2 mM DOPC em óleo mineral e (B) 0,2 mM DOPC em óleo de silicone AR20 (* a amostra foi diluída 10x para permitir uma distinção clara de GUVs sob um microscópio de contraste de fase). A análise realizada após a seção 4 do protocolo mostra uma distribuição de tamanho deslocada para diâmetros mais altos para a amostra de óleo mineral em relação às amostras de óleo de silicone AR20. No entanto, o rendimento da amostra de silicone é quase 20x maior. Abreviaturas: GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td>Condição E</td>
			<td>Condição P</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>4,11 gramas</td>
			<td>17.11 gramas</td>
			<td>Massa de sacarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>2,16 gramas</td>
			<td>2,16 gramas</td>
			<td>Massa de glicose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>Concentração de sacarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>Concentração de glicose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>Óleo de silicone</td>
			<td>Óleo mineral</td>
			<td>Fase oleosa para LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>Seringa de vidro de 0,1 mL</td>
			<td>Seringa de vidro de 0,5 mL</td>
			<td>Seringa de vidro para transferência de DOPC em soluções de clorofórmio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.10</td>
			<td>63 μL</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>Volume de DOPC em solução de clorofórmio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.16</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Volume de óleo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4.1</td>
			<td>3300 g 20 minutos</td>
			<td>500 g 45 minutos</td>
			<td>Condição de centrifugação</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Variações no protocolo. A tabela relata variações para várias etapas do protocolo (indicadas na primeira coluna) para preparar duas populações GUV diferentes: GUVs carregadas com sacarose (condição E) e GUVs carregadas com micropartículas (condição P).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ID</td>
			<td>Etapas envolvidas</td>
			<td>Diâmetro interno (mm)</td>
			<td>Diâmetro externo (mm)</td>
			<td>Comprimento (mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1.2.1; 1.2.3</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.2.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1.2.1; 1.2.6; 1.3.13</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Tubos para conexões de gás e vácuo na câmara de luvas. A tabela lista as dimensões dos tubos de silicone usados para conectar a câmara das luvas às linhas de nitrogênio e vácuo. IDs de referência são fornecidas para facilitar o processo de montagem.

Usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes

Over the past two decades, the droplet transfer method, also known as inverted emulsion, double emulsion, phase transfer, or emulsion transfer, has proven ...

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