Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Estamos analisando a interação de células imunes e tecidos danificados após o infarto do miocárdio. Nosso objetivo é entender a resposta imune e melhorar a função cardíaca. Foi proposto que, após o infarto do miocárdio, todas as três principais entidades celulares, cardiomiócitos e células e células imunes devem ser moduladas por estratégias multi-alvo ao mesmo tempo.

Além da análise simultânea do dano cardíaco e da resposta, pudemos mostrar a localização 3D dessas áreas danificadas, o que antes era desconhecido. A análise 3D, especialmente ao multiplexar vários alvos, fornece uma maneira mais robusta de avaliar a composição celular após o infarto do miocárdio. Para começar, coloque o camundongo sacrificado sob um microscópio estéreo.

Usando uma tesoura fina, abra a cavidade torácica e faça uma incisão na veia cava superior exposta perto da saída do vaso da caixa torácica até o pescoço. Usando uma agulha de calibre 27 conectada a uma bomba de rolo, perfunda o coração in situ através dos oráculos atriais direito e esquerdo com PBS contendo heparina. Confirme a remoção suficiente de sangue cardíaco observando o desbotamento da atração vascular superficial do coração e o clareamento do pulmão e do fígado.

Extirpar o coração junto com pelo menos cinco milímetros da aorta restante e do tecido pulmonar circundante usando fórceps e tesoura e transfira-o para uma placa de Petri de seis centímetros pré-preenchida com PBS gelado e gaze. Agora, corte o restante do pulmão, gordura e tecido dos vasos até que apenas o coração com aproximadamente cinco milímetros de aorta permaneça. Transfira o coração para uma placa preparada para canulação aórtica e puxe a aorta restante sobre uma cânula de aço romba de calibre 20.

Prenda-o ao entalhe da cânula com uma bela sutura 5-0. Legar a artéria descendente anterior permanentemente com sutura 6-0 no local utilizado para indução de infarto agudo do miocárdio reperfundido. Injete 400 microlitros de PBS contendo 20 microgramas de anticorpo NT CD31 de camundongo, marcado com um LexaFluor 546 retrógrado através da cânula inserida.

Retire cuidadosamente a cânula da aorta e transfira o coração para um tubo de reação de polipropileno de 15 mililitros contendo 10 mililitros de paraformaldeído a 4%. Incube o tubo durante a noite a quatro graus Celsius no escuro sem agitação. Lave o coração fixado em três trocas de cinco mililitros de PBS por 10 minutos cada em temperatura ambiente no escuro, usando rotação próxima acima da cabeça para agitação dentro de tubos de reação de polipropileno de cinco mililitros.

Desidrate o coração fixado em cinco mililitros de etanol a 50% em água deionizada por pelo menos duas horas em temperatura ambiente no escuro, agitando com rotação quase acima da cabeça em tubos de reação de cinco mililitros. Para branquear o coração desidratado, transfira-o para um tubo de reação de 15 mililitros contendo 10 mililitros de etanol 100% com 5% de sulfóxido de dimetila e 5% de peróxido de hidrogênio e incube-o a quatro graus Celsius no escuro por quatro horas sem agitação. Lave o coração branqueado em cinco mililitros de etanol a 100% três vezes por 12 horas cada em temperatura ambiente no escuro, usando rotação próxima acima da cabeça para agitação em tubos de reação de cinco mililitros.

Transfira o coração para um tubo de reação de cinco mililitros contendo quatro mililitros de cinamato de etila e incube-o sem agitação por três dias em temperatura ambiente no escuro. Corte os blocos de gel e goma limpos em um tamanho que estabilize o coração limpo no suporte de amostra do microscópio. Use uma lente objetiva de abertura numérica de 0,1 com uma distância de trabalho de 17,6 milímetros para aquisição de imagens.

Em seguida, detecte os sinais de fluorescência usando as configurações apropriadas do filtro de excitação e emissão. Para imagens de microscopia de folha de luz, escolha uma abertura numérica de folha de 0,079, resultando em uma espessura de folha de luz de cinco micrômetros. Defina a distância entre dois planos Z individuais para 10 micrômetros.

Use uma largura de folha de 100% para obter uma iluminação homogênea da amostra. As fatias cardíacas representativas localizando a área de risco, lesão endotelial e neutrófilos infiltrados usando coloração de anticorpos multicanal e autofluorescência são ilustrados nesta figura. A área de risco foi identificada pela ausência de coloração de CD31 após injeção retrógrada, lesão endotelial por negatividade intravenosa de CD31 e infiltração de neutrófilos por pontos positivos para Ly6G, principalmente perto de zonas de lesão.

As renderizações 3D mostraram sobreposição entre AAR, lesão endotelial e aglomerados de neutrófilos, sugerindo localização imune específica da região. A quantificação mostrou 90,2% de neutrófilos em RAA versus 9,8% em regiões remotas, indicando inflamação localizada. Dentro da RAA, 79,3% dos neutrófilos estavam fora dos volumes de lesão endotelial e 20,7% dentro, sugerindo agrupamento periférico em torno do dano.