Name: Preparação automatizada de 68Ga Ga-3BP-3940 em um módulo de síntese para imagens PET do microambiente tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a preparação automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 para imagens PET do microambiente tumoral usando o sintetizador GAIA V2. Este método garante conformidade com GMP e síntese em apenas 20 minutos.

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Nos últimos anos, o direcionamento do microambiente tumoral (TME) tem atraído considerável interesse em aplicações diagnósticas e terapêuticas1. A abundância de tipos de células, moléculas de sinalização e macromoléculas de matriz extracelular (MEC) dentro do TME oferece uma ampla gama de alvos moleculares potenciais2. Entre as células hospedeiras residentes e infiltrantes, os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) formam um subconjunto distinto de fibroblastos dentro do TME, fenotipicamente diferente dos fibroblastos normais. Os CAFs desempenham papéis cruciais na progressão do tumor, metástase, evasão imunológica e resistência à terapia por meio de características celulares e moleculares únicas3. Essas células mesenquimais exibem um fenótipo ativado marcado pela expressão da proteína de ativação de fibroblastos (FAP). Molecularmente, as CAFs secretam uma matriz complexa de citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, IL-6 e CXCL12) e proteínas ECM (por exemplo, colágeno, fibronectina), que remodelam a ECM e promovem um ambiente pró-tumorigênico4.
Como uma proteína altamente específica que é superexpressa e localizada na superfície extracelular da membrana CAF, a FAP exibe todas as características de um alvo molecular confiável, especialmente para aplicações em medicina nuclear e radiofármaco5. Nesse contexto, inibidores de pequenas moléculas de FAP (FAPI) à base de quinolina, funcionalizados com um grupo DOTA, foram desenvolvidos e rapidamente introduzidos em uso clínico 6,7,8. Especificamente, FAPI-04 e FAPI-46 radiomarcados com gálio-68 (emissor β+, t1/2 = 68 min) para tomografia por emissão de pósitrons (PET) demonstraram valor significativo em doenças fibróticas, cardiologia e oncologia 8,9, particularmente para cânceres em que [18F]fluorodesoxiglicose ([18F]FDG) tem utilidade limitada10. No entanto, embora suas contribuições para a oncologia e imagens de doenças não malignas sejam inegáveis, os FAPIs de moléculas pequenas exibem certas limitações para aplicações de terapia com radionuclídeos direcionados (TRT), particularmente devido ao seu tempo de residência intratumoral abaixo do ideal, o que pode levar à irradiação não intencional de tecido saudável11. Para resolver essa questão, várias estratégias têm sido exploradas, como o desenho de ligantes multivalentes11,12 ou o uso de radionuclídeos terapêuticos com meias-vidas curtas 13,14,15. Novos andaimes moleculares com alta afinidade por FAP e desencadeando uma alta proporção de internalização celular também foram desenvolvidos.
Um deles é o derivado pseudopeptídico FAP-2286. Contém uma sequência de 7 aminoácidos, ciclizada e ligada a um quelante DOTA por uma porção 1,3,5-benzenotrimetantiol16. Um estudo inicial em humanos demonstrou que o [68Ga]Ga-FAP-2286 exibe um perfil de biodistribuição semelhante ao [68Ga]Ga-FAPI-46, com captação fisiológica ligeiramente maior no fígado, rins e coração17. Neste estudo, 64 pacientes, principalmente com câncer de pescoço, fígado, estômago, pâncreas, ovários e esôfago, foram submetidos a imagens PET com [68Ga]Ga-FAP-2286 para estadiamento do câncer ou detecção de recorrência: a captação de [68Ga]Ga-FAP-2286 foi notavelmente maior do que [18F]FDG em tumores primários, metástases linfonodais e metástases à distância, aumentando o contraste da imagem e a detectabilidade da lesão. Todos os tumores primários foram visíveis com [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT, enquanto [18F]FDG PET/CT perderam quase 20% das lesões. Para linfonodos envolvidos, as taxas de detecção foram maiores com [68Ga]Ga-FAP-2286, bem como para metástases ósseas e viscerais. Outro estudo em um grupo menor de 21 pacientes com uma variedade de doenças oncológicas também demonstrou a excelente sensibilidade desse agente de imagem, refletindo a eficiência diagnóstica do [68Ga]Ga-FAP-228618. Estudos mais específicos têm se concentrado em um único tipo de câncer, como câncer urotelial ou de pulmão, destacando mais uma vez o alto potencial do [68Ga]Ga-FAP-2286 para imagens moleculares clínicas 4,5. Em relação à terapia, um estudo preliminar investigou o uso de FAP-2286 radiomarcado com lutécio-177 (emissor β-, t1/2 = 6,7 d) em 11 pacientes com diversos cânceres metastáticos progressivos19. A maioria dos pacientes recebeu dois ciclos de tratamento com intervalo de 8 semanas, e a dose média administrada por ciclo foi de 5,8 ± 2,0 GBq de [177Lu]Lu-FAP-2286. A droga demonstrou retenção intratumoral prolongada, com meia-vida efetiva de aproximadamente 44 h em metástases ósseas. Dados os efeitos colaterais aceitáveis, esses achados abriram caminho para ensaios clínicos em larga escala: a segurança e a eficácia do [177Lu]Lu-FAP-2286 estão atualmente sendo avaliadas no ensaio clínico de fase 1/2 LuMIERE, patrocinado pela Novartis (NCT04939610)7,8. Outros protocolos de pesquisa em menor escala estão documentados na literatura 9,20, e vários relatos de casos foram publicados 21,22,23,24,25,26, demonstrando a eficácia e excelente tolerabilidade desse TRT.
Modificações mínimas na estrutura feitas no FAP-2286 levaram ao análogo otimizado 3BP-3940 (Figura 1)27. Embora a literatura científica sobre essa molécula vetorial permaneça limitada, estudos iniciais foram conduzidos para aplicações terapêuticas e de imagem. Um relatório preliminar descreve o uso de [68Ga]Ga-3BP-3940 em 18 pacientes com vários carcinomas metastáticos em estágio terminal e conclui que este radiofármaco é um agente de imagem PET adequado, enfatizando sua excelente relação tumor-fundo e captação renal muito baixa28. Em outro trabalho, um único paciente com câncer de pâncreas com metástases hepáticas recebeu 150 MBq de [68Ga]Ga-3BP-3940 para PET, que demonstrou intensa captação no tumor primário e lesões metastáticas29. O mesmo paciente recebeu posteriormente uma dose única de 9,7 GBq de [177Lu]Lu-3BP-3940 para TRT. O tratamento foi bem tolerado, sem alterações significativas nos sinais vitais ou parâmetros biológicos. Um estudo diferente apresentou os resultados humanos iniciais de uma abordagem teranóstica usando 3BP-3940: os pacientes foram selecionados com imagens PET [68Ga]Ga-3BP-3940 e, em seguida, receberam 3BP-3940 marcado com diferentes isótopos (177Lu, 90Y ou 225Ac), administrados isoladamente ou em combinações em tandem (por exemplo, 177Lu + 225Ac) em 1-5 ciclos de tratamento30. Os resultados incluíram uma remissão completa, quatro remissões parciais, três doenças estáveis e 12 progressões da doença. A sobrevida global mediana da coorte (n = 28) foi de 9 meses desde o início do TRT.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68356/68356fig01.jpg"> 
Figura 1: Estrutura química de [68Ga]Ga-3BP-3940. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68356/68356fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O processo de radiomarcação de 68Ga para radiofármacos experimentais, como FAP-2286 e 3BP-3940, geralmente envolve um módulo de síntese para automatizar a etapa de preparação. Notavelmente, a automação do método garante a robustez do processo e a conformidade com as BPF e minimiza a exposição do operador à radiação em comparação com os métodos de preparação manual 31,32,33. Em muitos casos, tal protocolo é esperado pelas autoridades regulatórias como parte de um dossiê de medicamento experimental (IMPD) antes de autorizar um centro a fabricar o radiofármaco experimental correspondente34. Até o momento, muito pouca informação detalhada sobre a radiomarcação automatizada de 68Ga de pseudopeptídeos anti-FAP está disponível na literatura 29,35,36,37,38. Além disso, os dados relatados geralmente se aplicam apenas a um determinado modelo de sintetizador. O tipo de gerador de 68Ga utilizado também pode trazer certas especificidades, pois as diferentes soluções disponíveis comercialmente são caracterizadas por volumes específicos de eluato de 68Ga3+ em HCl (geralmente 0,1 M), o que pode ter um impacto direto nas condições de radiomarcação automatizada.
Neste contexto, apresentamos um protocolo detalhado para a radiomarcação automatizada rápida e eficiente do pseudopeptídeo 3BP-3940 com 68Ga, utilizando o módulo de síntese GAIA V2. Este sintetizador depende do uso de um conjunto de tubos composto por três rampas de cinco coletores cada, conectadas a uma bomba peristáltica para controlar o fluxo de fluido. Ele também possui um forno de frascos para aquecimento do meio de reação, várias sondas de radioatividade e um sensor de pressão para monitorar esses parâmetros dentro do sistema. Embora não seja tão difundido quanto alguns outros modelos, este autômato é usado rotineiramente em nosso centro e é instalado em um número crescente de instalações 31,39,40,41,42,43,44. Um gerador GALLIAD 68Ge/68Ga foi utilizado neste trabalho sem pré-purificação do eluato de 68Ga. Este método foi projetado para oferecer uma solução robusta, rápida e conveniente para a produção de [68Ga]Ga-3BP-3940, otimizando também a proteção contra radiação para os operadores durante a radiomarcação. Este também é o primeiro protocolo de preparação para este radiofármaco a ser relatado neste modelo específico de sintetizador, e com tantos detalhes.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; filtros</td><td>VWR</td><td>514-0515</td><td>Para filtração de soluções tampão e antioxidantes e produto final de radiomarcação</td></tr><tr><td>Acetonitrilo para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-2.5L</td><td>Para controlo por HPLC da pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Acetato de amónio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238074</td><td>Para a preparação de uma das fases móveis para controlo de TLC</td></tr><tr><td>Coluna C18 para HPLC</td><td>VWR</td><td>EQV-3C18-1503</td><td>Para controle de HPLC da pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Calibrador de dose calibrado (CRC25)</td><td>Capintec-Para</td><td></td> <td>medir a radioatividade do produto final e dos vários componentes do módulo pós-síntese</td></tr><tr><td>Solução tampão de citrato, pH 4</td><td>Thermofisher</td><td>258585000</td><td>Fase móvel para controles TLC</td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf 5 mL Biopur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP0030119479</td><td>Para a preparação de soluções tampão e antioxidantes</td></tr><tr><td>Linha de extensão (30 cm)</td><td>Vygon</td><td>1159.03</td><td>Para a conexão do gerador ao conjunto de tubulações</td></tr><tr><td>Gerador de gálio-68</td><td>IRE Elit-Para</td><td></td> <td>geração in situ de cloreto de gálio [68Ga]</td></tr><tr><td>Contador gama (Hidex AMG)</td><td>Hidex-Para</td><td></td> <td>avaliação de meia-vida e pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Estação HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>-</td><td>Para controle por HPLC de placas</td></tr><tr><td>iTLC-SG de pureza</td> radioquímica <td>Agilent</td><td>SGI0001</td><td>Para controle TLC de pureza radioquímica</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>AppliChem</td><td>A1340</td><td>Para preparação de solução antioxidante</td></tr><tr><td>Adaptador macho/macho</td><td>Vygon</td><td>893.00</td><td>Para a conexão do gerador ao conjunto de tubulação</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390-1L</td><td>Para a preparação de uma das fases móveis para controlo de TLC</td></tr><tr><td>Agulhas (21G, Sterican)</td><td>B Braun</td><td>4657543B</td><td>Para transferências de solução antes da radiomarcação</td></tr><tr><td>de pH VWR</td><td></td><td>85409.600</td><td>Para testar o pH do produto de radiomarcação</td></tr><tr><td>Pipeta 1000 &micro; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12346132-1000</td><td>Para medição precisa de líquidos e transferência</td></tr><tr><td>Pipeta 200 &micro; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12326132-200</td><td>Para medição precisa de líquidos e transferência</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta, 100-1000 &mu; L</td><td>Charles River</td><td>D1000IW</td><td>Para medição precisa de líquidos e transferência</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta, 2-200 &mu; L</td><td>Charles River</td><td>D200IW</td><td>Para medição e transferência precisas de líquidos</td></tr><tr><td>Radiocromatógrafo</td><td>Elysia-Raytest-Para</td><td></td> <td>controle TLC da pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Radiossensor para HPLC</td><td>Elysia-Raytest-Para</td><td></td> <td>controle HPLC da pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Kit de reagentes</td><td>ABX</td><td>RT-101</td><td>Fornece etanol 60%, NaCl 0,9%, saco WFI, cartucho C18, 0,2 e micro; filtro terminal, agulhas de aeração, agulha terminal e frasco de resíduos</td></tr><tr><td>Recipiente blindado</td><td>LemerPax</td><td></td><td>Para atenuação de radiação do produto de radiomarcação</td></tr><tr><td>Espátula de plástico descartável</td><td>Corning</td><td>3005</td><td>Para a preparação de reagentes</td></tr><tr><td>Acetato de sódio trihidratado EMPROVE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.28204</td><td>Para preparação de tampão de reação</td></tr><tr><td>Frascos selados estéreis (tipo vidro 1)</td><td>Curium</td><td>TC-ELU-5</td><td>Para o condicionamento final de soluções de tampão, antioxidantes e radiomarcação</td></tr><tr><td>Conjunto de tubos estéreis</td><td>ABX</td><td>RT-01-H</td><td>Para síntese automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>Água estéril para irrigação</td><td>B Braun</td><td>0082479E</td><td>Para a preparação de uma das fases móveis para controle de TLC</td></tr><tr><td>Módulo de síntese (GAIA)</td><td>Elysia-Raytest</td><td>-</td><td>Para síntese automatizada de seringa [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>(1 mL, baixo volume morto)</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Para condicionamento de peptídeo em tampão e adição de metionina em NaCl 0,9%</td></tr><tr><td>Seringas (10 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309649</td><td>Para metionina em NaCl 0,9% e</td></tr><tr><td>seringas de condicionamento (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td>Para condicionamento de metionina e etanol 60%</td></tr><tr><td>Tanques de migração TLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td>Para controle TLC de pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (adequado para HPLC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td>Para controle de HPLC de pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Tubos para contador gama</td> <td>-</td><td></td> <td>Para preparação de ensaios de meia-vida e pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Selecta</td><td>3000683</td><td>Para sonicação de soluções preparadas</td></tr><tr><td>Molécula vetorial (3BP-3940)</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P10131&nbsp;</td><td>Molécula vetorial a ser radiomarcada</td></tr><tr><td>Frasco para injetáveis para HPLC com inserção de vidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>29385-U e SU860066</td><td>Para controlo de HPLC da pureza radioquímica</td></tr><tr><td>Misturador de vórtices</td><td>VWR</td><td>444-5900P</td><td>Para agitar as soluções preparadas</td></tr><tr><td>Água para HPLC Sigma</td><td>Aldrich</td><td>34877-2.5L-M</td><td>Para controlo da pureza radioquímica por HPLC</td></tr><tr><td>Água para preparações injetáveis, balões de 10 mL</td><td>Aguettan</td><td>34009 370 641 0 1</td><td>Para soluções preparação</td></tr></tbody></table>

preparação automatizada de [68ga]ga-3bp-3940 em um módulo de síntese para imagens pet do microambiente tumoral

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

O processo de síntese desenvolvido no módulo GAIA permite a rápida radiomarcação de 68Ga de 3BP-3940 em 21-22 min. Este protocolo foi projetado para funcionar com o gerador GALLIAD de grau farmacêutico 68Ge/68Ga, que produz 1,1 mL de eluato de 68Ga em HCl 0,1 M. O volume e a molaridade do tampão de reação foram finamente ajustados de acordo com essa quantidade de ácido para obter um pH de reação entre 3,5 e 4, necessário para a marcação radioativa ideal45</sup...

Preparação automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 em um módulo de síntese para imagens PET do microambiente tumoral

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

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