Isolamento, cultura e caracterização de fibroblastos associados ao câncer de próstata
1 de agosto de 2025
Este protocolo fornece um procedimento abrangente para isolar, expandir e imortalizar fibroblastos de prostatectomias radicais. Além disso, descreve ensaios desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais da diafonia de células tumorais de fibroblastos, aproveitando tanto o tratamento com meio condicionado quanto a co-cultura.
Nosso objetivo é entender o mecanismo pelo qual os fibroblastos associados ao câncer contribuem para a progressão tumoral no câncer de próstata com o objetivo de neutralizar esse crosstalk como estratégia terapêutica. Populações distintas de CAFs com diferentes propriedades podem ser avaliadas em organoides 3D obtidos usando células tumorais e estromais após várias manipulações. Nosso protocolo permite gerar CAFs de forma confiável para esses fins.
Os principais desafios são o isolamento confiável de células tumorais e normais dos microambientes dos mesmos pacientes, heterogeneidade, ausência de marcadores CAF específicos, plasticidade dos CAFs e os modelos in vitro limitados que recapitulam a complexidade do TME. Com métodos semelhantes, caracterizamos o papel pró-tumoral fundamental do fator de transcrição STAT3 e seus genes-alvo em CAFs de câncer de mama murino, demonstrando sua eficácia como alvos terapêuticos. Um isolamento ideal de fibroblastos do tumor e das regiões normais adjacentes de espécimes de prostatectomia radical obtidos de pacientes com câncer de próstata usando pequena quantidade do tecido.
Para começar, pese as amostras de tecido na balança no primeiro dia para isolamento de fibroblastos. Usando uma pinça estéril, transfira o tecido para pratos de seis centímetros. Lave o lenço duas vezes em quatro mililitros de PBS gelado e duas vezes em quatro mililitros de DMEM completo gelado.
Agora, transfira o tecido para uma placa de seis centímetros no gelo. Adicione um mililitro de DMEM suplementado com antibiótico ao prato. Em seguida, use tesouras ou lâminas para picar o tecido em fragmentos menores que um milímetro quadrado.
Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEM completo gelado. Em seguida, centrifugar a suspensão a 754 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta de 10 mililitros, remova o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de DMEM completo gelado e centrifugue novamente. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em solução de colagenase II. Transfira a suspensão para microtubos de 1,5 mililitro.
Sele os microtubos com filme de parafina. Em seguida, coloque-os a 37 graus Celsius para digestão durante a noite com balanço contínuo por oito a 12 horas. No dia seguinte, transferir as amostras digeridas para tubos cônicos de 15 mililitros.
Pipete cinco mililitros de DMEM completo gelado para inativar a colagenase. Em seguida, centrifugar a suspensão a 754 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em um mililitro de 0,05% de tripsina-EDTA após pipetar o sobrenadante.
Incube por cinco minutos a 37 graus Celsius com agitação ocasional. Em seguida, pipete um mililitro de solução de DNase I recém-preparada para as amostras e misture bem. Depois de centrifugar e remover o sobrenadante, ressuspender o pellet em cinco mililitros de DMEM completo a frio e centrifugar novamente.
Ressuspenda as células resultantes em DMEM completo suplementado com 20% de soro bovino fetal. Coloque as células em placas e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por pelo menos três dias. Após três dias, examine as células quanto à morfologia e viabilidade.
Assim que as células atingirem a confluência, passe-as para um prato de 10 centímetros contendo DMEM completo com soro bovino fetal a 20%. Fibroblastos associados ao câncer de placa ou fibroblastos normais a 70% de confluência em placas de 12 poços. No dia seguinte, adicione 0,45 gramas de ágar de baixo ponto de fusão a 12,5 mililitros de PBS em um tubo cônico de 50 mililitros em condições estéreis.
Dissolva a mistura usando um forno de micro-ondas. Resfrie a solução de ágar até 37 graus Celsius. Em seguida, dilua na proporção de um para quatro com DMEM completo pré-aquecido para preparar uma solução de trabalho.
Aspire o meio da placa de 12 poços. Pipete 500 microlitros da solução de ágar de trabalho em cada poço. Incubar durante 20 minutos a quatro graus Celsius para permitir a solidificação do ágar.
Enquanto isso, mantenha a solução de ágar restante a 37 graus Celsius. Tripsinizar as células tumorais e preparar uma suspensão celular de 20.000 células por mililitro. Misture volumes iguais da suspensão de células tumorais e da solução de ágar para obter um volume final de sete mililitros, totalizando três réplicas técnicas por cada condição.
Pipete para cima e para baixo várias vezes para garantir uma mistura uniforme. Em seguida, dispense 500 microlitros dessa mistura contendo aproximadamente 5.000 células no topo da camada de base solidificada em cada poço. Depois de deixar o ágar-ágar solidificar por 20 minutos a quatro graus Celsius, adicione um mililitro de DMEM completo a cada poço.
Troque o meio a cada dois dias, aspirando suavemente da borda do poço e adicionando meio fresco ao centro. Incube até que as colônias se tornem facilmente visíveis. Assim que as colônias estiverem visíveis, descarte o meio de cultura.
Em seguida, core as colônias com 200 microlitros de solução de cloreto de tetrazólio azul Nitro. Incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada. No dia seguinte, descarte a solução de coloração.
Adquira imagens de colônias coradas usando um microscópio estereoscópico. Os fibroblastos puros foram isolados com sucesso. Em muitos casos, particularmente nas primeiras passagens, os fibroblastos associados ao câncer exibiram uma morfologia mais fusiforme em comparação com os fibroblastos normais.
A análise quantitativa confirmou que a proliferação de células DU145 tratadas com meios condicionados de fibroblastos associados ao câncer foi significativamente maior em 120 horas do que aquelas tratadas com meios condicionados de fibroblastos normais ou deixados sem tratamento. As células DU145 co-cultivadas diretamente com fibroblastos associados ao câncer e fibroblastos normais também mostraram aumento da proliferação ao longo de 96 horas em relação aos controles. As curvas de crescimento correspondentes demonstraram que a co-cultura com fibroblastos normais e associados ao câncer resultou em um aumento semelhante na proliferação de DU145 ao longo do tempo.
O efeito do meio condicionado na proliferação de DU145 variou entre pares de fibroblastos associados ao câncer e fibroblastos normais, com pares de passagem precoce mostrando efeitos significativamente mais fortes do que os posteriores. Em ensaios de formação de colônias de ágar mole, os fibroblastos normais e associados ao câncer aumentaram o número e o tamanho das colônias de DU145 em comparação com os controles, indicando maior crescimento independente da ancoragem. Camadas de fibroblastos destacadas formadas devido a problemas técnicos impediram a formação de colônias em algumas repetições.
O meio condicionado sozinho não promoveu a formação de colônias independentes de ancoragem em células DU145.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para o isolamento, expansão e imortalização de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) a partir de espécimes de prostatectomia radical. Também detalha ensaios para avaliar as interações funcionais entre fibroblastos e células tumorais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Os CAFs desempenham um papel significativo na progressão tumoral do câncer de próstata.
- Diferentes populações de CAFs exibem propriedades distintas.
- Os desafios incluem o isolamento de células a partir de microambientes tumorais complexos.
- Os modelos atuais podem não replicar completamente o microambiente tumoral.
Objetivo do Estudo
- Compreender os mecanismos pelos quais os CAFs contribuem para a progressão do câncer de próstata.
- Neutralizar a comunicação cruzada entre fibroblastos e células tumorais como uma estratégia terapêutica potencial.
- Gerar CAFs confiáveis para fins experimentais.
Métodos Utilizados
- Isolamento de fibroblastos de tecidos tumorais e tecidos normais adjacentes.
- Uso de organoides tridimensionais para avaliação das propriedades dos CAFs.
- Caracterização de fatores de transcrição como STAT3 em CAFs.
- Ensaios para avaliar os efeitos funcionais das interações entre fibroblastos e tumores.
Resultados Principais
- Geração confiável de CAFs a partir de espécimes de câncer de próstata.
- Identificação de populações distintas de CAFs com papéis variados na progressão tumoral.
- Demonstração do papel pró-tumoral da STAT3 em CAFs.
- Informações sobre alvos terapêuticos para o tratamento do câncer de próstata.
Conclusões
- O protocolo permite o estudo de CAFs no câncer de próstata.
- Compreender as interações entre CAFs e tumores pode levar a novas terapias.
- São necessárias pesquisas adicionais para enfrentar os desafios na caracterização de CAFs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e a caracterização confiáveis de fibroblastos associados ao câncer de próstata (CAFs) e seus equivalentes normais permitem a redução mecanicista da contribuição estromal para a progressão tumoral. Esse sistema pareado oferece confiança preditiva na validação de alvos e na investigação funcional da comunicação cruzada entre tumor e estroma, impactando diretamente pontos críticos na descoberta inicial e na pesquisa translacional. A abordagem fornece uma plataforma reutilizável para avaliar mecanismos oncogênicos impulsionados por CAFs e a possibilidade de atingimento terapêutico em diferentes portfólios oncológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite comparação direta de CAFs e fibroblastos normais do mesmo paciente para validação robusta de alvos.
- Apóia a desmistificação mecanicista de fatores estromais que influenciam a proliferação e migração de células tumorais.
- Facilita a avaliação funcional de alvos candidatos, como STAT3, no microambiente tumoral.
- Oferece um sistema experimental pareado para esclarecer as contribuições específicas de vias para a oncogênese.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece sistemas de células primárias validados para ensaios funcionais e triagem de compostos.
- Permite ensaios reprodutíveis de co-cultivo e de meio condicionado para quantificar as respostas das células tumorais.
- Apoia a padronização de leituras de crescimento e proliferação independentes de aderência em fluxos de trabalho de triagem.
- Permite escalabilidade e reutilização na avaliação de múltiplas hipóteses terapêuticas direcionadas às interações estromais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com a biologia estromal relevante para doenças, permitindo a exploração translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de intervenções direcionadas a CAFs.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a quantificação do impacto estromal sobre fenótipos tumorigênicos.
- Fornece subsídios mecanicistas sobre a oncogênese impulsionada por CAFs para o aprimoramento de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, triagem funcional e validação translacional de alvos estromais no câncer de próstata e potencialmente em outros tipos de tumores.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste da hipótese nula sobre os efeitos mediados por CAF no comportamento das células tumorais e na ativação de vias.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de proliferação e crescimento independente de ancoragem para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Permite a comparação estatística dos efeitos pareados de CAF e fibroblastos normais em múltiplas condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados mecanicistas *in vitro* com a biologia estromal relevante para a doença, alinhando biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para avaliação de alvos estromais em diversos programas de oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos estromais e reduz a ambiguidade mecanicista nas interações tumor-estroma.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios funcionais utilizando células humanas primárias.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper projetos e a eficiência do capital ao esclarecer as contribuições estromais para a progressão tumoral.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de estratégias terapêuticas direcionadas a CAFs e moduladoras do estroma.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias, cultivo e execução de ensaios funcionais.
- Exige acesso a espécimes teciduais derivados de pacientes e infraestrutura analítica apropriada.
- Necessita padronização entre equipes de protocolos para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para uso com outros tipos de tumores ou sistemas modelo com base na heterogeneidade estromal.
- As limitações técnicas incluem plasticidade dos fibroblastos, ausência de marcadores universais de CAF e complexidade dos modelos in vitro.
