Dessorção/ionização a laser assistida por matriz guiada por fluorescência com espectrometria de massa de postionização induzida por laser de células neurais de ratos individuais

Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de fluxos de trabalho de espectrometria de massa MALDI de célula única, guiados por imagem, de alto rendimento para revelar a heterogeneidade celular e vincular os perfis moleculares à identidade, função e resposta celular em sistemas complexos.

Instrumentação avançada, como MALDI-2 e espectrômetros de massa de alta resolução espacial, permite análises direcionadas e espacialmente resolvidas de células individuais, aumentando a sensibilidade e expandindo o escopo do perfil molecular em tecidos complexos. Os desafios atuais incluem sensibilidade limitada, reprodutibilidade entre amostras e análise de dados complexa. Os dados MALDI costumam ser esparsos e grandes conjuntos de dados com milhares de células e centenas de moléculas exigem ferramentas computacionais robustas.

Este protocolo aborda a lacuna nos métodos de alto rendimento para analisar células individuais e até organelas, permitindo estudos muito detalhados de heterogeneidade e obtendo insights sobre a biologia e função molecular e celular.

Este protocolo permite uma análise rápida e direcionada de células espalhadas pela lâmina, eliminando a necessidade de manipulação celular ou varredura de área total e aumentando significativamente o rendimento.

[Narrador] Para começar, enxágue cada lâmina com dois a três mililitros de acetato de amônio 150 milimolar para remover glicerol e cristais de sal que podem interferir na microscopia e na aplicação da matriz MALDI e, em seguida, seque as lâminas sob um fluxo suave de nitrogênio ou deixe-as secar completamente ao ar. Carregue a lâmina seca no microscópio stage. Focalizar o microscópio utilizando pelo menos 10 pontos de apoio distribuídos uniformemente por toda a lâmina. Usando filtros adequados para DAPI e imagens de campo claro, adquira uma imagem de fluorescência lado a lado de toda a lâmina com ampliação de 5x a 10x, garantindo que os marcadores fiduciais nas lâminas de microscopia sejam claramente capturados na imagem. Costure as imagens lado a lado usando um software de microscopia, como o ZEN ZEISS. Verifique se os ladrilhos adjacentes verticalmente não estão deslocados. Processe e exporte cada imagem unida como um arquivo BigTIFF usando o software de microscopia ou como um TIFF padrão se o tamanho final da imagem for inferior a dois gigabytes. Dissolva 20 miligramas de 2,5-di-hidroxiacetofenona em 1,5 mililitros de acetona. Coloque as lâminas no suporte da câmara de sublimação e, em seguida, coloque o suporte no aparelho de sublimação. Pipetar a solução de matriz dissolvida para a bolacha cerâmica e deixar a acetona evaporar completamente, depois fechar a câmara de sublimação para a selar. Encha a câmara de refrigeração com uma lama de água gelada e coloque-a firmemente em cima da câmara de sublimação. Ligue a bomba de vácuo e deixe o sistema se equilibrar por cinco minutos. Comece a sublimação aquecendo a câmara a 200 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, remova o banho de água gelada da câmara. Gire a temperatura para 25 graus Celsius e coloque um dissipador de calor em cima da câmara. Ventile lentamente a câmara de sublimação para liberar a pressão. Abra a câmara e remova cuidadosamente as lâminas. Abra o MicroMS e dizime as imagens de microscopia BigTIFF usando a opção de grupo de imagens para acomodar canais de campo claro e fluorescência. Navegue até a ferramenta Opções de Blob e ajuste o tamanho máximo e mínimo do blob para definir o intervalo de tamanho de blob aceitável. Defina o limite do canal de fluorescência para detecção de blob. Especifique o valor de circularidade para definir o quão circulares as células identificadas precisam ser para consideração e escolha a cor. Use a opção Localizar Blob para detectar blobs. Quando solicitado, salve a lista de blobs com um nome desejado. Use a ferramenta Filtro de distância para definir a distância mínima entre cada célula. Teste o erro por meio de pontos de teste para determinar com precisão o erro de deslocamento. Carregue os slides no instrumento usando o adaptador de slides MTP II. Depois de retornar ao computador com MicroMS, acesse o computador do espectrômetro de massa por meio de um aplicativo de área de trabalho remota. Se estiver usando o instrumento pela primeira vez, verifique sua posição navegando até Ferramentas, seguido de Configurações do instrumento. Na janela pop-up, visualize o conjunto de coordenadas com suas posições X e Y e selecione cada um desses pontos específicos na geometria do Adaptador de slides II. Atualize as posições X e Y na janela MicroMS. Usando a câmera do espectrômetro de massa e os controles do estágio, navegue até um local facilmente identificável no slide e copie as coordenadas do instrumento. No MicroMS, localize a mesma posição na imagem do microscópio, clique com o botão direito do mouse e insira as coordenadas na janela pop-up. Arredonde as coordenadas para os inteiros mais próximos e separe-as por um espaço. Depois que três pontos de registro forem adicionados, um dos círculos ficará vermelho, indicando que é a posição mais fora do registro. Exclua o ponto de registro usando Control + clique com o botão direito do mouse e tente novamente. Em Arquivo, vá para Salvar e, em seguida, Registro para salvar o arquivo de registro. Com as bolhas visíveis no slide, vá para File, Salvar e, em seguida, posições do instrumento para salvar a posição do instrumento file e, em seguida, usando o software de área de trabalho remota, transfira esse file para o computador do instrumento. Abra o arquivo XEO personalizado e copie seu conteúdo para o MTP Slide Adapter II . XEO no computador do instrumento. Salve o arquivo para atualizar esse arquivo de geometria com as localizações das células. Clique na guia Automação e selecione Novo para criar uma nova execução automática. Arraste pela região de amostra exibida para selecionar as células e clique com o botão direito do mouse para adicioná-las à lista de análise. Salve a execução automática e clique em Iniciar execução automática para iniciar a aquisição. Esta figura ilustra como o perfil de espectrometria de massa MALDI-2 de célula única revela heterogeneidade celular baseada em lipídios entre e dentro de regiões cerebrais distintas. A aproximação e projeção de variedades uniformes, ou análise UMAP, separou as células por região do cérebro, formando grupos distintos para estriado, hipocampo e córtex. O agrupamento de Leiden revelou quatro subpopulações de células baseadas em lipídios. Além disso, foram observadas assinaturas lipídicas específicas do cluster, com perfis de intensidade distintos entre os lipídios anotados. Os espectros de massa de seis células corticais também mostraram detecção consistente de lipídios nas lâminas. Além disso, as células corticais de diferentes lâminas mostraram distribuições UMAP sobrepostas, indicando efeitos mínimos de lote.