Name: Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a visualizar organoides retinianos inteiros com resolução celular usando microscopia confocal de montagem completa. Este método combina limpeza óptica e imunomarcação para revelar organização 3D e conexões neuronais em modelos de doenças retinianas.

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1. Preparação de anticorpos secundários fluorescentes feitos por medida
NOTA: Esta abordagem serve como uma alternativa ao uso de anticorpos fluorescentes comerciais (consulte a discussão sobre as vantagens da preparação de anticorpos secundários fluorescentes). Além disso, este protocolo pode ser usado para conjugar fluoróforos a anticorpos primários caso a imunofluorescência direta seja realizada e o anticorpo primário fluorescente não esteja disponível comercialmente. Controlar a proporção de fluoróforo-anticorpo ajustando a quantidade de fluoróforo na reação de marcação produz anticorpos conjugados mais brilhantes. No entanto, os anticorpos secundários feitos sob medida são menos estáveis e a concentração do conjugado resultante é 10 vezes menor do que a dos anticorpos fluorescentes comerciais. Esse protocolo é adaptado do trabalho descrito por Bálint et al9.
<ol>
	<li>Dissolver 1 mg do fluoróforo em DMSO anidro e alíquota em tubos para obter 0,02 mg de fluoróforo por tubo final. Remova todo o DMSO usando um concentrador de vácuo de velocidade, funcionando por 1 h e 30 min. Armazenar alíquotas a -20 ºC protegidas da luz. Para Alexa Fluor 405, o H2O ultrapuro é o solvente apropriado para fazer alíquotas.</li>
	<li>Para realizar a reação de marcação, dissolva uma alíquota do fluoróforo em 1-10 μL de DMSO (ou H2O ultrapuro para Alexa Fluor 405). NOTA: A quantidade exata de DMSO é determinada por meio de testes anteriores de conjugação de controle. Esses testes são realizados quando um novo lote de um fluoróforo deve ser usado (ou quando um lote de fluoróforo anterior se esgota) ou quando um novo fluoróforo é usado pela primeira vez na conjugação. O teste de conjugação de controle envolve a realização de reações de marcação com quantidades variáveis de fluoróforo para determinar a proporção ideal de fluoróforo-anticorpo no conjugado. No nosso caso, a proporção ideal normalmente fica entre 3 μL e 5 μL.</li>
	<li>Incube 50 μL de IgG secundário (ou primário), 6 μL de NaHCO3 1 M e 1-5 μL de fluoróforo por 40 min à temperatura ambiente (RT) em uma plataforma de balanço, protegida da luz.</li>
	<li>Enquanto a reação está progredindo, prepare as colunas de exclusão do tamanho da purificação removendo suas tampas e deixando o tampão passar. Equilibre a coluna (uma para cada reação de marcação) executando 3 x 2-3 mL de PBS através da coluna. Caso a última etapa de equilíbrio termine antes do término da incubação, coloque as tampas de volta para evitar que sequem e espere até que a reação de rotulagem termine. NOTA: As colunas de exclusão do tamanho da purificação funcionam por gravidade. Certifique-se de que a coluna não seque em nenhum momento, ou a reação de purificação não funcionará corretamente.</li>
	<li>Quando a reação terminar (etapa 1.3), adicione 140 μL de PBS à reação de marcação para tornar o volume de aproximadamente 200 μL e vorticá-lo. Adicione esta solução ao centro da coluna, permita que a amostra entre na coluna e, após a última gota ter eluido, empurre adicionando 550 μL de PBS. Quando o líquido parar de cair, eluir adicionando 300 μL de PBS e coletar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Calcular a concentração de anticorpos e as proporções de rotulagem medindo a absorvância da amostra a 280 nm e a absorbância dos fluoróforos utilizados. Aplicar a Lei de Beer-Lambert para determinar a concentração (em molaridade) da seguinte forma: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> Onde A representa a absorbância, ε o coeficiente de extinção molar e CF280 é uma medida da absorbância que o fluoróforo específico tem a 280 nm que serve como fator de correção. Então, a concentração do anticorpo é: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> E a proporção de rotulagem é: 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>Conservar os anticorpos marcados a 4 ºC, protegidos da luz, até 6 meses.</li>
</ol>
2. Marcação de imunofluorescência
<ol>
	<li>Fixe os organoides com paraformaldeído (PFA) a 4% em RT por 45 min. NOTA: OPCIONAL: Incubar os organoides com uma solução de recuperação de antígenos (etapas 2.2 e 2.3) para aumentar a imunorreatividade dos antígenos.</li>
	<li>Preparar 40 ml de solução de recuperação de antigénio misturando 0,117 mg de citrato de sódio tribásico di-hidratado em H2O ultrapuro e ajustar para pH 9.</li>
	<li>Incubar os organoides com a solução de recuperação de antigénios com agitação ligeira (30 rpm) a 60 °C durante 1 h.</li>
	<li>Permeabilize os organoides com PBST (PBS com 1% de Triton X-100) com leve agitação em RT por 4 h.</li>
	<li>Bloqueie os organoides com solução de bloqueio (albumina de soro bovino (BSA) a 2% com Triton X-100 a 0,1%) em RT durante a noite (ou mais de 1 dia). NOTA: As concentrações de anticorpos primários e secundários dependem do anticorpo específico. Para imunofluorescência de amostras de montagem total, usamos uma concentração mais alta em comparação com amostras seccionadas. Incubamos o anticorpo primário a 10 μg/mL que, na maioria dos casos, corresponde a 1:100 do estoque (Tabela 1). Incubamos nossos anticorpos secundários personalizados a 20-50 μg/mL.</li>
	<li>Incubar os organoides com os anticorpos primários diluídos em solução de lavagem (0,1% BSA com 0,1% Triton X-100) a 4 °C durante 2 dias com agitação ligeira.</li>
	<li>Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT.</li>
	<li>Incubar os organoides com os anticorpos secundários diluídos em solução de lavagem a 4 °C durante 2 dias com agitação ligeira.</li>
	<li>Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT. NOTA: Após a imunomarcação, os corantes fluorescentes de escolha podem ser incubados. Normalmente usamos marcadores de núcleos fluorescentes, como DAPI (1:1.000) e DRAQ5 (1:500), ou faloidina (1:100) para visualizar a rede de filamentos de actina.</li>
	<li>Incubar os organoides com os corantes fluorescentes diluídos em solução de lavagem em RT durante 1 h com agitação suave.</li>
	<li>Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT.</li>
</ol>
3. Limpeza óptica com FluoClear BABB
NOTA: 1-Propanol pode comprometer recipientes de plástico, principalmente para exposição a longo prazo. Para estar seguro, use recipientes de vidro.
<ol>
	<li>Etapa de desidratação<ol>
		<li>Preparar soluções de 1-propanol em H2O ultrapuro nas percentagens indicadas (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) e depois ajustar para pH 9,5 com trimetilamina. CUIDADO: A trietilamina é tóxica se inalada. Trabalhe sob uma coifa. As soluções podem ser reutilizadas se armazenadas adequadamente (recipiente bem fechado). Ajuste o pH antes de usar.</li>
		<li>Incubar as amostras com o gradiente crescente de soluções de 1-propanol (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) durante 2 h cada a 30 °C com agitação ligeira.</li>
		<li>Incubar as amostras com 100% de 1-propanol durante a noite a 30 °C com agitação suave.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etapa de limpeza CUIDADO: BABB é uma potente mistura de solventes conhecida por sua capacidade de dissolver ou danificar significativamente muitos plásticos. Por segurança, use recipientes de vidro com tampas compatíveis e trabalhe dentro de uma hotte.<ol>
		<li>Prepare o BABB misturando álcool benzílico (BA) e benzoato de benzila (BB) na proporção de 1:2.</li>
		<li>Mergulhe as amostras em BABB em RT durante a noite.</li>
		<li>Antes de criar imagens, atualize o BABB. NOTA: Para organoides de ~ 1 mm de diâmetro, o BABB induz um efeito de limpeza que é evidente em dezenas de minutos. Dependendo do tamanho e da natureza da amostra, o grau de limpeza pode ser diferente e/ou exigir um tempo de exposição mais longo à solução de limpeza. Recomendamos adquirir imagens antes e depois da imersão em BABB para melhorar o protocolo de limpeza.</li>
		<li>Armazene as amostras limpas de BABB com solução de BABB a longo prazo a 4 °C. Proteja da luz para preservar a fluorescência.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Aquisição de imagem de montagem total
<ol>
	<li>Usando uma pipeta de vidro, posicione o organoide em uma placa de Petri com fundo de vidro com uma gota de BABB. Certifique-se de que a amostra entre em contato com a superfície da lamínula. CUIDADO: Tome cuidado para que a gota de BABB contendo a amostra não entre em contato com as bordas plásticas do prato, ou derreterá o plástico, comprometendo a amostra e a qualidade da imagem.</li>
	<li>Usando um microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com objetivas de baixa e alta ampliação, adquira imagens de pilha Z para obter uma visão 3D completa da amostra com detalhes celulares. NOTA: Para este estudo, foram utilizadas uma objetiva de ar de abertura numérica (NA) de 10x 0,4 e uma objetiva de 63x NA 1,4, com um tamanho de passo de 3,5 μm e 1 μm, respectivamente.</li>
</ol>
5. Processamento de imagem
<ol>
	<li>Recalibre o tamanho do passo da aquisição da pilha Z considerando a incompatibilidade do índice de refração (RI) entre a solução de limpeza e o meio de imersão.<ol>
		<li>Calcule o tamanho do passo recalibrado da seguinte forma: 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> Para uma amostra incorporada em BABB, fotografada com uma objetiva aérea com um tamanho de passo de 3,5 μm, será a seguinte: 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>Usando o ImageJ, altere a profundidade do voxel (clique em Imagem | Propriedades...) para o tamanho da etapa recalculado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie projeções de imagem da pilha Z.<ol>
		<li>Usando o ImageJ, inspecione a pilha Z em profundidade (clique em Imagem | Pilhas | Vistas ortogonais). As vistas XY, XZ e YZ do organoide retiniano aparecerão.</li>
		<li>Salve as regiões de interesse desejadas (clique em Arquivo | Salvar como...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie uma animação da renderização 3D da pilha Z usando software de processamento (consulte a Tabela de materiais).<ol>
		<li>Selecione os canais a serem visualizados ativando suas caixas de seleção.</li>
		<li>Ajuste os planos Z para visualizar o interior da amostra (ative Recorte na caixa de seleção).</li>
		<li>Grave a animação usando o Editor de filmes (ative o Editor de filmes na caixa de seleção). Arraste e solte, aumente e diminua o zoom diretamente usando o mouse. Clique em Adicionar para incluir um clipe diferente para a animação. Se estiver ajustando os planos Z, ative a opção Planos de recorte (clique em Configurações... | marque a caixa Recortar planos ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>10x NA0.40 objetiva DRY</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x objetiva NA1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td>-</td></tr><tr><td>Álcool benzílico (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzoato de benzilo (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>placa de Petri de vidro inferior</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Rolamento A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>anticorpo Chx10</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Colunas de filtragem de gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermofisher</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Corante (ácido carboxílico, éster succinimidílico)</td><td>Invitrogen ou Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido de varredura a laser</td><td>Microssistemas Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>Software de processamento 3D LAS X</td><td>Microssistemas Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Água ultrapura do sistema de purificação de água Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Orgânicos</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>IgG secundária não marcada</td><td>Jackson Imunopesquisa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo azul de opsina</td><td>Millipore&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo Opsin RG</td><td>Millipore</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA) 4%</td><td>Termocientífico&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>Solução PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sondas de marcação de faloidina</td><td>Thermofisher</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>anticorpo RECOV</td><td>Millipore</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>RHO (RET-P1) anticorpo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Tritão X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>TUJ1 anticorpo</td><td>Covance&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

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Este artigo vídeo demonstra o estabelecimento de culturas de retina organotípicas wholemount e um procedimento para análise de cytospin exogenamente efeitos induzidos. Organotípicas retina culturas wholemount imitar...

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Montagem de organoides retinianos com microglia

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a visualizar organoides retinianos inteiros com resolução celular usando microscopia confocal de montagem completa. Este método combina limpeza óptica e imunomarcação para revelar organização 3D e conexões neuronais em modelos de doenças retinianas.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

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