Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Nosso trabalho se concentra no desenvolvimento e estudo de organoides retinianos que servem como modelo humano in vitro para estudar como a retina humana se forma, como as doenças afetam e como podemos tratá-las.

Para avançar na pesquisa no campo da medicina regenerativa, usamos organoides retinianos 3D combinados com limpeza óptica e imunomarcação para visualizar estruturas inteiras e estudar a organização especial das células da retina com microscopia confocal.

A imagem de montagem inteira enfrenta desafios, como penetração desigual de anticorpos em tecidos densos e aberração esférica em organoides, que causam rotulagem de viés de superfície e perda de foco durante a visualização do tecido.

Nosso método revela conexões de células da retina, tipos de células, sob organização 3D, fornecendo informações cruciais sobre as causas subjacentes das doenças da retina.

[Instrutor] Para começar, obter as alíquotas de fluoróforo dissolvidas em DMSO anidro, desidratadas e congeladas. Adicione 1 a 10 microlitros de DMSO a uma alíquota. Agora, combine 50 microlitros de imunoglobulina G secundária ou anticorpo primário, seis microlitros de bicarbonato de sódio molar e um a cinco microlitros de fluoróforo e incube em uma plataforma de balanço por 40 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Enquanto a reação está progredindo, remova as tampas das colunas de exclusão do tamanho da purificação e deixe o tampão passar. Equilibre a coluna executando três rodadas de dois a três mililitros de PBS através da coluna. Se o último equilíbrio terminar antes do término da incubação, coloque as tampas de volta para evitar que se desenhem e espere que a reação termine. Após a incubação, adicione 140 microlitros de PBS à reação de marcação para trazer o volume para aproximadamente 200 microlitros e vortex-o. Adicione a solução ao centro da coluna e deixe-a entrar na coluna. Depois que a última gota tiver escapado, empurre a solução com 550 microlitros de PBS. Quando o líquido parar de cair, eluir com 300 microlitros de PBS e coletar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Meça a absorbância da amostra em 280 nanômetros e nos comprimentos de onda específicos do fluoróforo para calcular a concentração de anticorpos e as taxas de marcação. Armazene os anticorpos marcados a quatro graus Celsius, protegidos da luz, por até seis meses. Fixe os organoides retinianos com aldeído paraforme a 4% em temperatura ambiente por 45 minutos. Após a fixação, adicione a solução de recuperação de antígeno sobre os organoides e incube o prato a 60 graus Celsius, com agitação suave a 30 rotações por minuto por uma hora. Em seguida, permeabilize os organoides com PBS contendo 1% de Triton X-100. Incubar a mistura à temperatura ambiente, agitando ligeiramente durante quatro horas. Agora, bloqueie os organoides em 2% BSA com 0,1% Triton X-100 em temperatura ambiente durante a noite ou por mais de um dia. No dia seguinte, adicione anticorpos primários diluídos aos organoides. Incubar a quatro graus Celsius por dois dias com agitação leve. Lave os organoides três vezes por 15 minutos cada em solução de lavagem em temperatura ambiente com agitação suave. Agora, adicione os anticorpos secundários da solução de diluição e incube a quatro graus Celsius por dois dias com agitação leve. Depois de lavar os organoides conforme demonstrado anteriormente, incubar os organoides com corantes fluorescentes diluídos em solução de lavagem à temperatura ambiente por uma hora com agitação suave. Em seguida, lave novamente. Em seguida, prepare soluções de 1-propanol em água ultrapura nas concentrações de 15%, 30%, 45%, 60%, 75% e 90% e ajuste cada uma para pH 9,5 com trimetilamina. Desidratar as amostras sequencialmente em gradientes crescentes de soluções de 1-propanol por duas horas cada a 30 graus Celsius com agitação leve. Em seguida, transfira a amostra para solução de 100% de 1-propanol e incube durante a noite a 30 graus Celsius com agitação suave. Para limpeza da amostra, prepare a mistura de álcool benzílico e benzoato de benzila na proporção de um para dois para fazer a solução BABB. Mergulhe as amostras em BABB em temperatura ambiente durante a noite. Atualize a solução BABB antes de criar imagens. Com uma pipeta de vidro, posicione o organoide em uma placa de Petri com fundo de vidro com uma gota de BABB, garantindo que ele entre em contato com a superfície da lamínula. Agora, use um microscópio de varredura a laser confocal invertido com objetivas de baixa e alta ampliação para adquirir imagens Z-stack para resolução celular 3D. Recalibre o tamanho do passo da aquisição da pilha Z levando em conta a incompatibilidade do índice de refração entre a solução de limpeza e o meio de imersão. Agora, inicie o ImageJ, atualize a profundidade do voxel selecionando Imagem e clicando em Propriedades para criar projeções de imagem da pilha Z. Inspecione a profundidade da pilha Z selecionando Imagem, depois Pilhas e escolhendo Visualizações ortogonais para exibir as visualizações XY, XZ e YZ do organoide retiniano. Salve as regiões desejadas clicando em Arquivo e selecionando Salvar como. Por fim, crie uma animação da renderização 3D da pilha Z usando o software de processamento. Os organoides retinianos limpos com glicerol de frutose mostraram a menor melhora na transparência, dificultando a visualização do núcleo organoide. A limpeza ECI melhorou a visualização das camadas da retina, mas ainda não conseguiu revelar o núcleo organoide devido ao espalhamento persistente da luz. Os organoides limpos Fluoclear BABB exibiram a maior transparência, revelando claramente o córtex e o núcleo com fluorescência consistente. Os organoides limpos ECI e fluoclear BABB exibiram encolhimento visível em imagens de campo claro devido às etapas de desidratação. O encolhimento induzido por BABB aumentou a compactação da amostra, permitindo o uso de objetivas de alta ampliação para obter imagens de estruturas mais profundas. A imunomarcação de TUJ1 aos 40 dias in vitro mostrou uma única camada neuronal fina sem estratificação visível. Aos 90 dias, as células povoaram densamente a região apical e, aos 170 dias, o organoide exibiu sinais claros de organização em camadas com uma zona apical definida. Aos 200 dias, as projeções celulares alongadas se estenderam para dentro da superfície até o núcleo, e o organoide se desenvolveu em três camadas distintas da retina aos 250 dias. As fibras neuronais se estendiam do centro organoide em direção à periferia ao longo da maturação, tornando-se mais espessas e complexas em 250 dias in vitro. Os fotorreceptores de cone expressando opsinas azuis e verdes/vermelhas apareceram em estágios tardios e mostraram morfologias alongadas com pontas brilhantes. Os fotorreceptores de bastonetes que expressam rodopsina foram identificados por seus núcleos centrais e distribuição periférica de opsina. As células positivas para Chx10 foram inicialmente distribuídas amplamente, mas depois localizadas especificamente na camada nuclear interna durante a maturação do organoide. A expressão endógena de GCaMP6s foi preservada após a limpeza de BABB, com sinal de GFP detectável na retina neural após fixação de longo prazo.