Microscopia eletrônica de transmissão como técnica de visualização para análise da plasticidade sináptica circadiana no córtex de barril de camundongo

Estamos interessados na plasticidade neural, particularmente nas mudanças circadianas na plasticidade das sinapses, neurônios e células gliais. Estamos tentando responder à pergunta como as sinapses são transformadas durante o dia e a noite e sob condições patológicas. Os desenvolvimentos mais recentes em nosso campo de estudos é usar várias ferramentas genéticas para manipular com a expressão gênica, também usando métodos para visualizar mudanças no cérebro, assim como há um número crescente de modelos animais para estudar doenças neurodegenerativas. Descobrimos, usando microscópio de transmissão eletrônica, que o número de sinapses no córtex cilíndrico de camundongos muda durante o dia e a noite. E esse ritmo também é circadiano, pelo menos no caso de sinapses inibitórias. Como as sinapses inibitórias, elas aumentam em número durante a noite, enquanto as sinapses excitatórias aumentam durante o dia. Mudanças semelhantes encontramos no cérebro da mosca da fruta. Nesta espécie, também o número de sinapses muda durante o dia e a noite. E, além disso, encontramos mudanças estruturais na forma dos neurônios e células gliais.

[Narrador] Para começar, pegue o cerebelo do camundongo e divida o cérebro em dois hemisférios. Escolha um hemisfério e oriente-o de forma que as seções possam ser cortadas tangencialmente ao córtex do barril. Em seguida, corte as seções com espessura de 60 micrômetros e transfira-as para uma solução contendo tampão fosfato 0,1 molar e fixador na proporção de um para cinco. Examine as seções sob um microscópio óptico e colete apenas as seções que mostram claramente o córtex do campo de barril. Usando um pincel, transfira suavemente as seções para uma pequena placa de Petri de vidro. Enxágue as seções cerebrais em cacodilato de 0,1 molar. Em seguida, fixe os cortes em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato 0,1 molar com ferricianeto de potássio a 1,5%. Depois que as seções forem enxaguadas em água destilada, use uma seringa com filtro de 25 milímetros para dispensar lentamente etanol a 70% contendo acetato de uranila a 1% em cada placa de Petri com tecidos. Após incubação noturna em etanol a 70% a quatro graus Celsius, lave os tecidos em etanol a 80%, 90% e 100%. Em seguida, lave os tecidos duas vezes em óxido de propileno por 10 minutos cada. Em seguida, substitua o óxido de propileno por dois mililitros de uma mistura um-para-um de resina Poly/Bed e óxido de propileno. Cubra com uma tampa e incube por 40 minutos. Incorpore as seções cerebrais em dois mililitros de uma mistura de três para um de resina Poly / Bed e óxido de propileno. Cubra e deixe por 1,5 horas. Em seguida, corte o filme ACLAR em pedaços correspondentes ao tamanho de uma lâmina de vidro padrão. Usando uma pipeta de plástico, aplique um pequeno volume de resina em cada peça de filme ACLAR. Com um pincel, transfira as seções cerebrais da placa de Petri para a resina no filme ACLAR. Incorpore cada seção entre dois filmes ACLAR e incube para polimerizar. Usando um microscópio óptico com uma objetiva de duas vezes, fotografe as seções cerebrais incorporadas. Para abrir as imagens, clique em Arquivo e Abrir, selecione as imagens enquanto mantém pressionada a tecla Shift e clique em Abrir. Comece a empilhar imagens do córtex. Clique com o botão direito do mouse na Camada 1 em cada imagem, selecione Duplicar camada e insira o número da imagem como o nome na caixa de diálogo. Escolha uma imagem como o arquivo de destino e clique em OK. Em seguida, use a ferramenta Mover para alinhar as imagens manualmente e ajustar a orientação com Editar, Transformar, Girar ou Inverter conforme necessário. Para ajustes mais precisos, use Editar, Transformar, Distorcer e mova os cantos individualmente para corresponder aos pontos de referência anatômicos. Defina o modo de mesclagem da camada superior para sobrepor no painel Camadas para facilitar o alinhamento. Em cada seção que exibe o córtex do barril, use um microscópio estéreo para identificar o barril selecionado e corte-o junto com o adjacente usando uma lâmina de barbear. Depois de embutir a seção no bloco de resina, colete as seções ultrafinas em grades de níquel de ranhura única revestidas com Formvar. Depois de alinhar a pilha de imagens TEM conforme demonstrado anteriormente, defina a área de análise. Clique em Camada seguido de Novo e Camada e clique em OK. Selecione a ferramenta Retângulo, vá para Camada, Estilo de Camada, Traçado. Defina a cor, a espessura e a posição do traçado para dentro e clique em OK. Agora, desenhe um retângulo para definir o limite da análise e selecione Preencher 0%. Para adicionar uma nova camada para anotações, selecione Camada, Novo, Camada e clique em OK. Use a ferramenta Pincel para marcar sinapses nesta camada. Use a ferramenta Zoom e a ferramenta Mão para garantir a precisão durante as anotações. Agora, abra a pilha de imagens destinada à reconstrução 3D. Selecione a ferramenta Cortar, marque a região que contém a coluna dendrítica na pilha e pressione Enter para cortar essa região em todas as camadas visíveis. Para tornar apenas uma camada visível por vez, alterne o ícone de olho no painel Camadas. Clique em Arquivo, Salvar como, nomeie o arquivo, selecione o formato JPG e clique em OK para salvar cada imagem cortada separadamente. Abra o software de reconstrução 3D. Antes de carregar, clique em Z na meta-alça de navegação ou pressione o teclado numérico 7 para alinhar a perspectiva da viewport. Em seguida, para carregar as imagens, clique em Adicionar, Imagem, Referência, selecione a primeira imagem e clique duas vezes para confirmar. Para posicionar a imagem TEM final ao longo do eixo z, clique na imagem. No painel Propriedades do objeto na barra lateral direita, insira o valor apropriado no campo Local Z. Para distribuir todas as imagens uniformemente ao longo do eixo z, selecione todos os objetos de imagem. Pressione Fim para abrir o painel Final. Navegue até a guia Editar e clique em Distribuir Z para espaçá-los automaticamente com base na espessura da seção. Para contornar manualmente a forma da coluna dendrítica em cada imagem TEM usando uma única curva por imagem, clique em Adicionar, Curva e Círculo. Para mover o círculo, segure g, arraste o mouse e clique para confirmar o posicionamento. Segure s para ajustar o tamanho e clique para confirmar. Em seguida, dimensione o objeto para alinhá-lo com a forma da coluna dendrítica. Agora, modifique a forma curva para caber no limite da lombada. Selecione um ponto de controle, pressione g, mova o ponto e clique para confirmar. Use as teclas g ou s conforme necessário para ajustar os pontos da alça, refinando a direção e a intensidade da curva. Para adicionar mais detalhes, mantenha pressionada a tecla Shift e selecione dois pontos de controle vizinhos. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e escolha Subdividir para inserir um novo ponto entre eles. Depois que a curva delinear com precisão a lombada, entre na guia Layout, clique com o botão direito do mouse no objeto do círculo de Bézier e escolha Duplicar objeto sem mover o mouse. Para conectar as arestas do objeto unido e formar uma malha fechada, entre na guia Modelagem. Pressione 2 para alternar para o modo de seleção de borda. Clique em Selecionar, Todos, clique com o botão direito do mouse e escolha Unir contornos de aresta para vincular os anéis de aresta. Para preencher a lacuna na parte superior do objeto, desmarque tudo clicando ao lado dele. Mantenha pressionada a tecla Alt e clique em uma borda da borda superior para selecionar o loop inteiro. Clique com o botão direito do mouse e escolha Extrudar arestas, arraste para cima ao longo do eixo z. Agora, pressione s, mova o mouse para dentro para reduzir o novo loop e clique para confirmar. Com o loop ainda selecionado, clique com o botão direito do mouse e escolha Nova face das bordas. Para suavizar a estrutura final, vá para a guia Modificadores na barra lateral direita. Clique em Adicionar modificador, navegue até Gerar e selecione Superfície de subdivisão. Defina os níveis de viewport e renderização como um para uma suavização consistente. Para atribuir cor a estruturas individuais, selecione o objeto desejado. Abra a guia Material na barra lateral direita, clique em Novo e defina a cor base. Selecione o objeto de luz para ajustar a iluminação da cena. Pressione e segure g, mova o mouse para reposicionar a luz e clique para confirmar sua nova localização. Para posicionar a câmera para renderização, oriente a viewport para ficar voltada para a coluna dendrítica como ela deve aparecer na saída final. Pressione Control + Alt + teclado numérico 0 para ajustar a câmera à visualização atual. Ajuste o quadro da câmera selecionando-o, segurando g e movendo-o para refinar o enquadramento. O córtex somatossensorial do camundongo era identificável mesmo em seções cerebrais não coradas, e todo o campo de barris poderia ser reconstruído usando ferramentas digitais, apesar da distribuição de barris individuais em várias seções. Imagens consecutivas de MET ultrafinas permitiram a classificação confiável das sinapses em tipos excitatórios ou inibitórios com base em evidências visuais seriais. A reconstrução tridimensional de espinhos dendríticos a partir de cortes seriados permitiu a visualização da morfologia da coluna, revelando diferentes formas, como espinhos finos, cogumelos, atarracados e intermediários. As formas da coluna foram quantificadas com base em medidas, incluindo comprimento da coluna, comprimento do pescoço e diâmetros da coluna, cabeça e pescoço.