Produção de um sistema de partículas semelhante ao vírus SARS-CoV-2 para investigar os ciclos de vida virais in vitro

Apresentamos um protocolo in vitro otimizado para a produção de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 que imitam de perto o vírus autêntico. Essa abordagem permite a investigação dos mecanismos de infecção, montagem e saída viral sem as restrições de exigir um laboratório de nível 3 de biossegurança.

Nossa pesquisa está focada em entender a biologia do vírus SARS-CoV-2 e tentar encontrar medicamentos, particularmente da medicina chinesa contra o SARS-CoV-2. Todo o estudo vivo do vírus SARS-CoV-2 deve ser controlado em um laboratório de nível três de biossegurança. E essa limitação experimental torna um estudo SARS-CoV-2 viável apenas em algumas vidas. O vírus SARS-CoV-2 como método prático do estudo sobre SARS-CoV-2 possível sem limitação de laboratório de nível três de biossegurança, e a lista será um método muito útil.

[Instrutor] Para começar, semeie aproximadamente 3 milhões de células HEK-293T em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros de diâmetro com meio completo DMEM, suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Cultive as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 24 horas. Verifique a fluência da célula ao microscópio. Diluir 60 microlitros de PEI de uma solução estoque de um miligrama por mililitro com meio sem soro para atingir um volume final de 200 microlitros. Agora, pegue 200 microlitros de meio livre de soro e adicione 6,7 microgramas de plasmídeo N, 10 microgramas de plasmídeo Luc-T20, 0,016 microgramas de plasmídeo S e 3,3 microgramas de plasmídeo M-IRES-E. Adicione suavemente a solução diluída de PEI à solução contendo plasmídeos que revestem as proteínas da estrutura viral e incube a mistura à temperatura ambiente durante 10 minutos. Esta é a solução de transfecção. Solte cuidadosamente a solução de transfecção nas células HEK-293T e gire suavemente a placa de cultura de tecidos para garantir uma mistura completa. Troque o meio de cultura celular pelo meio completo DMEM seis horas após a infecção e incube as células HEK-293T transfectadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Colete o sobrenadante das células HEK-293T infectadas, que contém as partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2. Filtrar o sobrenadante recolhido através de um filtro de seringa de 0,45 micrómetros para remover os detritos celulares. Este é o meio SC2-VLP. Semeie 40.000 células HEK-293T com expressão estável da enzima conversora de angiotensina 2, ou ACE2, e TMPRSS2 em uma placa de 96 poços e adicione 50 microlitros de meio SC2-VLP. Incube a placa de cultura de tecidos de 96 poços a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, remova o meio de cada poço da placa de 96 poços e lave uma vez com 100 microlitros de PBS pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Lise as células HEK-293T semeadas com células ACE2 TMPRSS2 com 20 microlitros de tampão de lise passiva e balance suavemente a amostra em um agitador orbital por 15 minutos em temperatura ambiente. Gire a placa de 96 poços a 4.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius usando uma centrífuga de microplacas refrigerada e, em seguida, transfira imediatamente a placa para um banho de gelo. Pegue 100 microlitros de tampão de ensaio de luciferase reconstituída em uma nova placa branca opaca de 96 poços e adicione 20 microlitros de lisado em cada poço. Misture brevemente pipetando para cima e para baixo duas a três vezes. Meça o sinal de luminescência usando um leitor de placas. Em seguida, para avaliar a composição do meio SC2-VLP, adicione 1,36 mililitros de solução de PEG 8000 a 10 mililitros de meio SC2-VLP. Coloque a mistura em uma coqueteleira orbital e misture lentamente a quatro graus Celsius durante a noite. Centrifugue a solução a quatro graus Celsius e 2.000 G por 30 minutos. E colete o pellet SC2-VLP para análise de western blotting. Semeie aproximadamente 3 milhões de células HEK-293T uniformemente em uma placa de cultura com fundo de vidro com 15 milímetros de diâmetro e permita que as células adiram e cresçam até atingirem aproximadamente 70% de confluência. Depois de seccionar as células conforme demonstrado anteriormente com as quantidades de plasmídeo modificadas, lave suavemente a placa de cultura duas vezes com um mililitro de PBS gelado. Adicione um mililitro de solução de fixação de aldeído paraforme a 4% à temperatura ambiente e incube por 15 minutos. Lave as células duas vezes por cinco minutos, cada uma com um mililitro de PBS em temperatura ambiente, e permeabilize as células adicionando um mililitro de Triton X-100 a 0,25% por 10 minutos. Novamente, lave as células duas vezes por cinco minutos cada com um mililitro de PBS em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de albumina de soro bovino a 5% por uma hora para bloquear interações de anticorpos não específicos. Adicione aproximadamente 200 microlitros de solução de anticorpo primário para cobrir o fundo do vidro e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, remova a solução primária de anticorpos e lave as células três vezes por cinco minutos cada com um mililitro de PBS em temperatura ambiente. Agora, adicione uma solução de anticorpo secundário conjugado com fluorescência e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois de lavar as células três vezes com PBS, corar os núcleos com 2,5 microgramas por mililitro de solução de Hoechst à temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, após lavar as células com PBS, observe a coloração da proteína S ou organela antes de adquirir imagens usando um microscópio confocal. Esta figura ilustra a sensibilidade da produção de SC2-VLP a quantidades variáveis de transfecção do plasmídeo que codifica a proteína spike. O título de SC2-VLP foi maior quando 0,016 microgramas de plasmídeo S foram transfectados e diminuiu significativamente com 0,16 e 1,6 microgramas de plasmídeo s. A mutação H1271 para E na proteína spike reduziu significativamente o título de SC2-VLP em comparação com o tipo selvagem. A mutação E1262 para H levou a uma redução moderada no título de SC2-VLP, enquanto a mutação dupla E1262 para H, H1271 para E aboliu totalmente a produção. As bandas de proteína S e S-2 de comprimento total foram diminuídas nas faixas E1262 a H e mutantes duplas, em comparação com o tipo selvagem. A eficiência de empacotamento S também foi reduzida nos mutantes E1262 para H e H1271 para E e quase abolida no mutante duplo. A abundância de VLP permaneceu praticamente inalterada entre os mutantes do tipo selvagem e todos os mutantes S. Proteína S do tipo selvagem colocalizada com o marcador cis-Golgi GM130, mas não com o marcador ER Sec61 beta ou marcador ERGIC ERGIC 53. A proteína S mutante H1271 para E exibiu distribuição citoplasmática difusa e não teve colocalização com GM130.