Um guia passo a passo para o isolamento e análise da superfície foliar e RNA apoplástico usando rosetas de Arabidopsis

Estamos tentando entender como as plantas regulam seus microbiomas e se os RNAs secretados pelas plantas regulam a expressão gênica em micróbios procarióticos e eucarióticos que colonizam as plantas. Usamos uma combinação de eletroforese de concha de alta resolução e análise baseada em Illumina para avaliar os RNAs presentes na superfície da folha e como eles mudam em resposta ao estresse biótico. Embora estudos recentes sugiram que os RNAs extracelulares são absorvidos por patógenos fúngicos e bacterianos, os mecanismos subjacentes da captação de RNA e as consequências funcionais dessa captação permanecem amplamente inexplorados.

Para começar, pegue plantas de arabidopsis de seis a sete semanas para cada replicação. Adicione a silhueta L-77 ao VIB estéril, antes de iniciar o isolamento da lavagem da superfície da folha. Em seguida, usando um cilindro medidor, transfira 100 mililitros da solução VIB preparada para um frasco de spray de 500 mililitros.

Usando uma tesoura fina, retire cuidadosamente as rosetas de arabidopsis de suas raízes. Depois disso, use uma escova macia para remover o excesso de sujeira das pétalas. Coloque as rosetas destacadas em uma bandeja plana com a superfície abaxial voltada para cima.

Em seguida, pulverize a superfície abaxial usando cinco bombas do frasco de spray cheio de VIB e agente umectante. Vire cuidadosamente as rosetas e borrife a superfície adaxial. Prepare seringas modificadas com orifícios na parte inferior, envolvendo-as com filme para ao redor do gargalo para suspender a ponta acima do fundo do frasco.

Para recuperar a lavagem da superfície da folha, insira suavemente as rosetas pulverizadas nas seringas modificadas sem agulha de 60 mililitros colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 mililitros e borrife duas bombas firmes de tampão na seringa. Em seguida, centrifugue os frascos carregados a 100 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora filtre a lavagem da superfície da folha recuperada através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetro e colete o filtrado em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, mantido em gelo.

Para o método de swab da superfície foliar, borrife as rosetas destacadas com o VIB e a solução de agente umectante da mesma maneira descrita na etapa anterior. Para recuperar o cotonete da superfície da folha, use palitos de ponta de algodão estéreis para esfregar as superfícies adaxial e abaxial das rosetas. Em seguida, pressione as pontas embebidas contra a parede interna de um tubo de centrífuga de 15 mililitros para extrair o líquido.

Filtre a amostra de swab da superfície da folha extraída, através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros em um tubo de dois mililitros colocado no gelo. Coloque o mesmo conjunto de plantas usado anteriormente para lavagem da superfície da folha ou isolamento do cotonete em um béquer limpo e enxágue-as suavemente duas vezes com água destilada. Para infiltrar as rosetas a vácuo com VIB, coloque cuidadosamente as rosetas enxaguadas em uma cafeteira francesa contendo 300 a 500 mililitros de VIB.

Fixe a tampa e baixe suavemente o êmbolo até que as rosetas estejam totalmente submersas. Insira a prensa francesa em uma câmara de vácuo e aplique um vácuo por 20 segundos usando uma bomba de vácuo até que as plantas estejam bem infiltradas. Depois de liberar o vácuo, remova a prensa francesa da câmara e retire a tampa.

Despeje o VIB em um copo de plástico de 500 mililitros e remova as rosetas. Em seguida, agite suavemente as rosetas e escove as folhas em uma toalha de papel para remover o excesso de tampão. Agora, usando papel mata-borrão, seque suavemente as superfícies das folhas para remover qualquer tampão restante.

Para coletar o fluido de lavagem aplástico, insira as rosetas infiltradas VIB em seringas sem agulha de 60 mililitros, colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 mililitros como feito anteriormente. Centrifugue os frascos a 600 G por 30 minutos a quatro graus Celsius com aceleração lenta. Em seguida, filtre o fluido de lavagem aplástica acumulado através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros em um tubo de 15 mililitros colocado sobre gelo.

Prepare ou compre um mini gel contendo 10 ou 15% de poliacrilamida e sete molares de uréia em tampão EDTA de ácido trisbórico, usando uma solução de acrilamida e bis. Em seguida, misture as amostras de RNA com tampão de carga desnaturante duas vezes. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e coloque-a imediatamente no gelo.

Agora resolva as amostras de RNA em 0,5 vezes o tampão de execução TBE à temperatura ambiente, aplicando 220 volts por aproximadamente uma hora e 15 minutos. Em seguida, core o gel com coloração de gel de ácido nucleico de ouro cibernético em 0,5 vezes TBE por 10 minutos. Enxágue o gel duas vezes com água destilada e faça uma imagem, usando um sistema de imagem.

Para quantificar as bandas de RNA resolvidas, use o método de análise de gel da documentação da Imagem J no menu de análise e análise de gel. Preparar padrões de RNA para duas réplicas técnicas diluindo o RNA do lisado celular em água livre de RNase e DNase. Para preparar a coloração de gel de ácido nucleico de ouro cibernético 1,5 vezes, dissolva-a em tampão tris HCL de 500 milimolares em pH oito.

Para a configuração da microplaca, adicione 99 microlitros de água destilada a cada poço. Em seguida, adicione um microlitro de RNA a cada poço usando o mesmo volume para amostras de RNA e padrões. Finalmente, adicione 50 microlitros de solução de ouro cibernético a cada poço.

Para definir os parâmetros do leitor de microplacas, escolha agitação linear ou orbital por três segundos. Defina o leitor de microplacas para o modo de ponto final de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 496 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 540 nanômetros. Construa uma linha de calibração, usando os valores de intensidade de fluorescência dos padrões de RNA.

A análise de gel de RNA desnaturante revelou que as amostras de lavagem da superfície da folha e fluido de lavagem aplástica contêm uma ampla gama de tamanhos de RNA, incluindo espécies de RNA longas e pequenas. As quantidades totais de RNA isoladas do fluido de lavagem aplástica e da lavagem da superfície foliar foram semelhantes, quando normalizadas para a massa fresca da planta. Os perfis de RNA de lavagem da superfície foliar, lavagem aplástica e lisado celular diferem acentuadamente, confirmando a contaminação mínima por RNA intracelular e mostrando que o RNA aplástico é altamente processado com bandas difusas de baixo peso molecular, adição de 0,001% de silhueta L-77 ao tampão de isolamento da vesícula quase dobrou o rendimento de RNA das superfícies foliares em comparação com o tampão sem o agente umectante.

Mas aumentar essa concentração para 0,01% não aumentou ainda mais a recuperação do RNA. Uma segunda lavagem das mesmas folhas recuperou aproximadamente 63% do RNA obtido na primeira lavagem, indicando secreção contínua de RNA na superfície da folha. A quantificação de RNA, usando ensaios de placa de microtitulação baseados em fluorescência, demonstrou alta linearidade com concentração de RNA para os métodos de detecção de ouro cibernético e RIBO 488.

Mostramos que o tRNA e os fragmentos derivados de tRNA, ou TDRs, são especialmente abundantes no RNA extracelular, provavelmente devido à sua resistência à degradação. Portanto, acreditamos que esses TDRs provavelmente regulam a expressão gênica em bactérias. Desejamos identificar as fontes celulares de RNA da superfície foliar e os papéis biológicos que essa RNase da superfície foliar pode estar desempenhando no contexto de interações microbianas planejadas.