Name: Bioimpressão de fatias de tumor de hidrogel como modelo 3D para linfoma de células do manto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a bioimpressão de fatias de tumor de hidrogel para estudar linfoma de células do manto em modelo 3D. Este método utiliza bioink de alginato e colágeno para analisar respostas a drogas e heterogeneidade tumoral.

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<ol><li>Jain, P., Wang, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma+in+2022-a+comprehensive+update+on+molecular+pathogenesis%2C+risk+stratification%2C+clinical+approach%2C+and+current+and+novel+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments.</a> Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+Bruton%27s+tyrosine+kinase+in+cancers%3A+Drug+development+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances.</a> Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1%2F2+study+of+zilovertamab+and+ibrutinib+in+mantle+cell+lymphoma+%28mcl%29+or+chronic+lymphocytic+leukemia+%28cll%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll).</a> J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).</li>
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<li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology%3A+Capturing+tumor+complexity+in+vitro%2Fex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models%3A+A+novel+approach+for+lymphoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).</li>
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<li>Medina, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+protect+mantle+cell+lymphoma+cells+from+spontaneous+and+drug-induced+apoptosis+through+secretion+of+b-cell+activating+factor+and+activation+of+the+canonical+and+non-canonical+nuclear+factor+%CE%BAb+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways.</a> Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).</li>
<li>Jindal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cers6-as1%2Ffgfr1+axis+as+synthetic+vulnerability+to+constrain+stromal+cells+supported+proliferation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma.</a> Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+patient-derived+organoid+culture+platform+for+mantle+cell+lymphoma+drug+sensitivity+and+car+t+cell+anti-tumor+activity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay.</a> Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).</li>
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<li>Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+evaluation+of+the+morphometric+patterns+of+lymph+nodes+of+the+head+and+neck+in+young+and+middle-aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals.</a> Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>&micro;-slide Fundo de vidro de 8 poços</td><td>ibidi GmbH</td><td>80827</td><td>Lâminas de fundo de vidro usadas para imagens ao vivo de fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>9150.1</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>10X RPMI-1640 Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1145</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Seringa à prova de gás de 2,5 ml modelo 1002 TLL</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>Seringa para bioimpressão</td></tr><tr><td>Impressora de extrusão 3D, PrintrBot Simple</td><td>Printrbot</td><td></td><td>Auto-modificado para permitir a impressão de biotintas</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Th. Geyer GmbH & Co.KG</td><td>7696790</td><td>Cultura das fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Sistemas de filtração a vácuo de topo de garrafa, membrana PES, 500 ml, 0,22 &micro; m tamanho do poro, 70&nbsp; membrana de mm de diâmetro</td><td>Corning Inc.</td><td>513-3355</td><td>Filtração estéril de tampões</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio desidratado</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>T885.2</td><td>Componente do tampão de lavagem e pasta de gelatina</td></tr><tr><td>Colágeno I de rato</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS354249</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Software Cura Versão 15.04.5 para impressão 3D</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>Software usado para impressão 3D</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus Ltda.</td><td>DR50050</td><td>Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Componente do tampão de dissolução de alginato</td></tr><tr><td>Contador automático de células EVE</td><td>Nano EnTek Inc.</td><td>10027-452</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Placas de Petri bacteriológicas Falcon com tampa, 35 mm de diâmetro</td><td>Falcão</td><td>351008</td><td>Preenchido com pasta de gelatina para formar o banho de suporte para bioimpressão</td></tr><tr><td>Tubos Falcon, 50 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.KG</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0615</td><td>Suplemento de meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Componente principal da pasta de gelatina</td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Livre, Grau de Biologia Molecular</td><td>Merck KGaA</td><td>CAS 7365-45-9</td><td>Componente do tampão de lavagem e pasta de gelatina</td></tr><tr><td>Linha celular Jeko-1 MCL</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linha celular MCL</td></tr><tr><td>Toalhetes de precisão KIMTECH Science</td><td>Corporação Kimberly Clark</td><td>7551</td><td>Usado para extrair o excesso de água da pasta de gelatina e para remover gotículas do bico da impressora 3D</td></tr><tr><td>Software LAS X Versão 3.5.7.23225</td><td>Leica</td><td></td><td>Software usado para reconstruções 3D</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>Microscópio confocal para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>Pote de Vidro Regular Pint 16 oz</td><td>Corporação Bola</td><td>G001</td><td>Frasco no qual a pasta de gelatina é preparada</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento Matrigel (TFG)</td><td>Corning Inc.</td><td>356231</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Inserção de cultura de células milicelulares, 0,4 &micro; tamanho do poro m</td><td>Merck KGaA</td><td>PICMORG 50</td><td>Suporte de filtro para fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Substrato NucView 405 Caspase-3, 1 mM em 1x PBS</td><td>Biotium</td><td>10405</td><td>Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Liquidificador Oster Professional Series</td><td>Oster</td><td>BPST02-B00</td><td>Liquidificador para gerar pasta de gelatina</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptamicina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>Suplemento para meio de cultura de células MCL</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>Pág. 7589</td><td>Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Rotina 35 R</td><td>Hettich</td><td>24573</td><td>Centrifugação de células</td></tr><tr><td>Centrífuga ROTINA 38/38R</td><td>Hettich</td><td>Z720109</td><td>Centrifugação de pasta de gelatina</td></tr><tr><td>RPMI-1640+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870036</td><td>Base do meio de cultura para células MCL</td></tr><tr><td>Alginato de sódio</td><td>Cooperação FMC</td><td>GQ9109901</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06404</td><td>Componente do tampão de dissolução de alginato</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>3580.1</td><td>Componente do tampão de dissolução de alginato</td></tr><tr><td>Cânulas de aplicação romba Sterican 21G 0,8x22 mm</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td>Bico para impressão 3D</td></tr><tr><td>Perclorato de tetrametilrodamina-éster metílico (TMRM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5428</td><td>Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel</td></tr><tr><td>Azul de tripano, 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Coloração para análise de viabilidade</td></tr><tr><td>Termômetro à prova d'água</td><td>VWR</td><td>620-2099</td><td>Termômetro para monitorar a temperatura da pasta de gelatina</td></tr></tbody></table>

bioimpressão de fatias de tumor de hidrogel como modelo 3d para linfoma de células do manto

Bioprinting of Hydrogel Tumor Slices as a 3D Model for Mantle Cell Lymphoma

As fatias tumorais de hidrogel contendo células MCL foram geradas com o protocolo descrito acima. As etapas do fluxo de trabalho para impressão 3D e cultura das fatias de tumor de hidrogel são mostradas na Figura 1A. A impressora 3D utilizada foi modificada para FRESH printing com a adição de um extensor de bomba de seringa, conforme descrito em Hinton et al.20 (Figura 1B). Até cinco fatias foram impressas de uma só vez (Figura 1C) e cultivadas em um suporte de filtro (Figura 1D). O meio foi adicionado abaixo do suporte do filtro para fornecer um suprimento de nutrientes para as fatias tumorais de hidrogel. Uma gota de meio foi adicionada em cima de cada fatia de tumor de hidrogel para evitar que secassem. Uma visão geral de cinco fatias de tumor de hidrogel cultivadas em um suporte de filtro é mostrada na Figura 1E, juntamente com imagens em close de uma fatia de hidrogel. Durante um período de cultura de 3 dias, os cortes tumorais de hidrogel permaneceram estáveis e mantiveram sua estrutura (Figura 2A). Logo após a impressão, bolhas de ar estavam presentes nas fatias do tumor de hidrogel, mas desapareceram durante o cultivo (Figura 2A).
A viabilidade da linhagem celular MCL Jeko-1 cultivada em fatias tumorais de hidrogel (3D) em comparação com células Jeko-1 cultivadas em cultura em suspensão (2D) foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano (Figura 2B). Após 3 dias de cultivo, 80% das células eram viáveis, em comparação com uma viabilidade inicial de 88% das células Jeko-1 antes da impressão. As células Jeko-1 cultivadas em 2D mantiveram a viabilidade inicial de 88%. Não houve diferença significativa entre as células Jeko-1 cultivadas em 2D e 3D. Para avaliar se as células Jeko-1 proliferam nas fatias de hidrogel, foi determinado o número médio de células Jeko-1 por fatia de hidrogel (Figura 2C). Enquanto 5x105 células Jeko-1 estavam contidas em cada fatia logo após a impressão (d0), esse número quase dobrou para 9,3x105 células após 3 dias de cultivo.
A distribuição e o status das células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel foram avaliados por imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores (Figura 2D) diretamente após a impressão ou após 3 dias de cultura. Após a impressão, as reconstruções 3D das fatias de hidrogel Jeko-1 mostraram uma distribuição homogênea das células. A maioria das células foi positiva para TMRM, um marcador para potencial de membrana mitocondrial22. Uma minoria de células foi positiva para a atividade da Caspase-3, um marcador para indução de apoptose23, bem como para o marcador de células mortas PicoGreen21. Após 3 dias de cultivo, foi observado um aumento no número de células juntamente com a formação de aglomerados de células. A maioria das células permaneceu positiva para TMRM, enquanto apenas algumas células foram positivas para atividade de Caspase-3 ou PicoGreen (Figura 2C).
Para analisar se as células do ligamento colateral medial em fatias de hidrogel respondem a quimioterápicos, as células Jeko-1 cultivadas em cultura em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) foram tratadas com a droga quimioterápica doxorrubicina, que faz parte do tratamento padrão para pacientes com LCM24. A estrutura geral das fatias de hidrogel foi mantida durante o tratamento com doxorrubicina (Figura 3A). A viabilidade das células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel diminuiu de forma dose-dependente em resposta ao tratamento com doxorrubicina. O IC50 da doxorrubicina em células Jeko-1 foi aumentado quando as células foram cultivadas em fatias de hidrogel (IC50 = 5,8 μM) em comparação com as células Jeko-1 cultivadas em cultura de suspensão 2D (IC50 = 2,0μM; Figura 3B). A imagem de fluorescência ao vivo em quatro cores mostrou um sinal TMRM reduzido e um aumento do sinal PicoGreen em células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel em resposta ao tratamento com doxorrubicina, confirmando uma redução da viabilidade induzida pelo tratamento. As imagens obtidas a partir de imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores foram reconstruídas em 3D, segmentadas com base no sinal dos núcleos DRAQ5 e analisadas usando o Python Script descrito no Arquivo Suplementar 1. Uma máscara de segmentação exemplar é mostrada na Figura Suplementar 1. O número de células identificado a partir do sinal DRAQ5 foi usado para determinar o número total de células. O número de células positivo para a atividade de TMRM, PicoGreen e Caspase-3 foi usado para identificar a porcentagem de células viáveis, mortas ou apoptóticas, respectivamente. As quantificações da coloração de fluorescência viva de quatro cores de células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel por 3 dias com ou sem 9 μM de doxorrubicina mostraram viabilidade comparável ao ensaio de exclusão de azul de tripano (Tabela 2).
Além das linhagens celulares MCL estabelecidas, as células MCL primárias de três pacientes MCL diferentes foram cultivadas em cultura de suspensão 2D ou em fatias de hidrogel 3D (Figura 4, Figura Suplementar 2). Conforme verificado por um patologista, todos os três MCLs (Paciente 1-3) eram de morfologia clássica/comum com índices Ki67 de 20%-50%. As células primárias do ligamento colateral medial incluíam todos os tipos de células isoladas dos linfonodos do paciente com ligamento colateral medial e, portanto, continham não apenas células do LCM, mas também outros tipos de células imunes ou células estromais. A viabilidade das fatias primárias de hidrogel MCL foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Após 4 dias de cultura, as células primárias do LCM em fatias de hidrogel mantiveram uma viabilidade de 43,6% (45,7% no dia 3) em comparação com uma viabilidade basal de 71,0% antes da impressão (Figura 4A). Isso representa um aumento da viabilidade em comparação com as células cultivadas em suspensão (2D), que tiveram uma sobrevivência de 19,6% após quatro dias de cultivo (28,4% no dia 3). Essa viabilidade foi visualizada por imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores, nas quais a maioria das células foi positiva para TMRM e viável, enquanto uma subpopulação foi positiva para atividade de Caspase-3 e PicoGreen, indicando apoptose e morte celular, respectivamente (Figura 4B). Os dados de quantificação da Figura 4B são mostrados na Tabela 2. As células primárias de mais dois pacientes com MCL mostraram um aumento da sobrevivência das células quando cultivadas nas fatias de hidrogel (3D) em comparação com a respectiva cultura em suspensão 2D (Figura Suplementar 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig1.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho de impressão 3D de fatias tumorais de hidrogel.(A) Fluxo de trabalho de impressão 3D e cultura de células em fatias tumorais de hidrogel. (B) Configuração da impressora usada para bioimpressão 3D de fatias de hidrogel em um banho de suporte de gelatina. (C) Impressão de um projeto no software da impressora 3D. Até cinco fatias de hidrogel foram impressas de uma só vez. (D) Representação esquemática da cultura de fatias de hidrogel. As fatias de hidrogel foram cultivadas em um suporte de filtro em uma placa de 6 poços. Uma gota de meio foi adicionada em cima de cada fatia de hidrogel para manter sua umidade. Até cinco fatias de hidrogel podem ser cultivadas em um suporte de filtro. (E) Fatias de hidrogel impressas em 3D cultivadas em um suporte de filtro, conforme mostrado por uma imagem geral ou por imagens em close-up. As barras de escala representam 5 mm, 1 mm ou 200 μm, conforme indicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig2.jpg"> 
Figura 2: Cultura de uma linhagem celular de linfoma de células do manto (MCL) em fatias de hidrogel impressas em 3D.(A) Close-up de uma fatia de hidrogel representativa contendo a linha celular MCL Jeko-1 após impressão (d0) ou após 3 dias de cultura (d3). A barra de escala representa 1 mm. (B) Viabilidade de células Jeko-1 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por 2 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A média ± DP de três experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. (C) Número de células Jeko-1 contidas em cada fatia de hidrogel imediatamente após a impressão (d0) ou após até 3 dias de cultura (d1-d3). A média ± DP de três experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. Não foi observada diferença estatisticamente significativa (n.s., p &gt; 0,05, teste de Mann-Whitney). (D) Reconstrução tridimensional de fatias de hidrogel Jeko-1 no dia da impressão (d0) ou após 3 dias de cultura (d3). O modelo foi gerado a partir de pilhas z de uma imagem de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores. As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig3.jpg"> 
Figura 3: Tratamento medicamentoso de uma linhagem celular de linfoma de células do manto (MCL) em fatias de hidrogel. (A) Close-up de uma fatia de hidrogel representativa contendo a linha celular MCL Jeko-1 tratada com 3 μM de doxorrubicina por 3 dias (d3). A barra de escala representa 1 mm. (B) Células Jeko-1 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) foram tratadas com concentrações crescentes do agente quimioterápico Doxorrubicina por 2 dias. A viabilidade das células foi avaliada pelo ensaio de exclusão do azul de tripano. A média ± DP de quatro experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. (C) Reconstrução tridimensional de fatias de hidrogel Jeko-1 tratadas com 9 μM de doxorrubicina (Doxo) por 3 dias (d3). O modelo foi gerado a partir de pilhas z de uma imagem de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores. As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig4.jpg"> 
Figura 4: Cultura de células primárias do LCM em fatias de hidrogel impressas em 3D. (A) Viabilidade de células primárias do LCM cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por até 4 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A viabilidade média de um experimento é mostrada. (B) Reconstrução tridimensional de células primárias do LCM cultivadas em fatias de hidrogel (3D) por 3 dias. As pilhas Z foram geradas a partir de fatias de hidrogel coradas com uma coloração viva de quatro cores e analisadas usando um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mancha</td>
			<td>TMRM</td>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Substrato NucView405 Caspase-3</td>
			<td>PicoVerde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitação/Emissão</td>
			<td>548 nm/574 nm</td>
			<td>647 nm/681 nm</td>
			<td>429 nm/ 469 nm</td>
			<td>488 nm/ 520 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Máximos de excitação/emissão das manchas usadas para imagens de fluorescência 3D ao vivo em quatro cores.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Amostra</td>
			<td colspan="3">% de células</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (células viáveis)</td>
			<td>PicoGreen (células mortas)</td>
			<td>Caspase-3 (células apoptóticas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Ctrl</td>
			<td>83</td>
			<td>23.6</td>
			<td>18.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Doxo 9 μM</td>
			<td>27.6</td>
			<td>81.3</td>
			<td>86.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paciente Primário 1 do LCM</td>
			<td>75.2</td>
			<td>31.1</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Quantificação de reconstruções 3D de coloração viva de quatro cores de fatias tumorais de hidrogel cultivadas. Fatias de tumor de hidrogel foram cultivadas por 3 dias e continham células Jeko-1 cultivadas com ou sem tratamento com 9 μM de doxorrubicina ou células MCL primárias (paciente 1).
Figura suplementar 1: Identificação celular a partir de reconstruções 3D de coloração viva de quatro cores. Reconstruções 3D de imagem confocal marcada com DRAQ5 obtida a partir de (A) coloração ao vivo de quatro cores e (B) uma imagem segmentada neste canal gerada usando o pipeline de análise de imagem Python. A barra de escala representa 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%201.tiff" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Figura suplementar 2: Cultura de células MCL primárias dos pacientes 2 e 3 em fatias tumorais de hidrogel.Viabilidade das células MCL primárias do (A) paciente 2 ou (B) paciente 3 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por até 4 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A viabilidade média de um experimento é mostrada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%202.tiff" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Instruções para análise de reconstruções 3D obtidas a partir de coloração ao vivo de quatro cores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_1_proof%20read%20version.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Script Python para análise de reconstruções 3D obtidas a partir de coloração ao vivo de quatro cores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_2.ipynb%20" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Codificação Suplementar File 1: Stl. arquivo contendo o projeto para as fatias de tumor de hidrogel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Hydrogel%20slice%208mm%201.5mm.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Bioimpressão de fatias de tumor de hidrogel como modelo 3D para linfoma de células do manto

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare, aggressive B-cell neoplasm that frequently relapses and only shows a limited response to conventional chemotherapy. ...

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Research

JoVE Journal

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