Medição de Monofosfato de Guanosina Cíclico (cGMP) em Tecidos Sólidos usando Ensaio Imunoenzimático Competitivo (ELISA)

O Laboratório Dechter pesquisa o metabolismo do óxido nítrico. O óxido nítrico estimula a formação cíclica de GMP por meio de uma cascata de homeostase adaptativa. Nosso objetivo é aprender como o envelhecimento, a dieta e outros fatores afetam essa cascata. Pesquisas anteriores se concentram na formação do óxido nítrico e nos efeitos fisiológicos resultantes ao negligenciar a cascata que conecta os dois. Nosso protocolo mede o GMP cíclico, um segundo mensageiro na cascata. Nosso protocolo é simples, acessível e facilmente adaptável a vários tipos de tecidos.

[Narrador] Para começar,

Coloque um pulverizador de tecido, uma pinça e uma colher sobre gelo seco por 10 minutos. Pese o excesso de tecido suíno para compensar a perda durante a pulverização. Transfira o tecido para o pulverizador resfriado colocado em gelo seco. Congele rapidamente o tecido despejando nitrogênio líquido no pulverizador e deixe-o vaporizar totalmente antes de prosseguir. Em seguida, recoloque a tampa do pulverizador e bata 15 vezes com um martelo. Agora, tara um tubo homogeneizador de contas em uma balança. Usando a colher e a pinça resfriadas, transfira o tecido pulverizado para o tubo. Pipete 0,1 ácido clorídrico normal no tubo de homogeneização, garantindo que o volume em microlitros seja um múltiplo da massa do tecido em miligramas. Em seguida, homogeneizar a amostra de tecido usando um homogeneizador de moinho de esferas. Centrifugue o homogenato a 17.000 g por 30 minutos, mantendo uma temperatura de amostra de quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante resultante para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue novamente por 10 minutos, mantendo uma temperatura de amostra de quatro graus Celsius. Pipetar uma alíquota do sobrenadante final para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo sobre gelo. Em seguida, pipete 9,9 mililitros de tampão ELISA em um tubo rotulado como Padrão B. Pipete 100 microlitros de solução padrão no tubo B padrão. Vortex completamente para garantir uma suspensão uniforme. Transfira 1.000 microlitros da solução do Padrão B para o tubo rotulado como Padrão 1. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão ELISA aos tubos rotulados como Padrão 0 e Padrões 2 a 8. Padrão de vórtice 1. Em seguida, transfira 500 microlitros da solução para o Padrão 2. Em seguida, faça o vórtice Standard 2 e transfira 500 microlitros da solução para o padrão 3. Continue transferindo 500 microlitros de cada padrão anterior para o próximo, fazendo vórtice completamente após cada edição até que o Padrão 8 seja preparado. Para a acetilação das amostras, adicionar 50 microlitros de hidróxido de potássio de quatro molares a uma alíquota de amostra de 250 microlitros. Adicione imediatamente 12,5 microlitros de anidrido acético. Vortex a solução por 15 segundos. Em seguida, pipete 12,5 microlitros de hidróxido de potássio de quatro molares e vórtice novamente. Ao tubo rotulado como Padrão 0, adicione 100 microlitros de hidróxido de potássio de quatro molares, seguidos imediatamente por 25 microlitros de anidrido acético. Após o vórtice, pipetar 25 microlitros de hidróxido de potássio de quatro molares no tubo e vórtice brevemente. Repita as adições de hidróxido de potássio e anidrido acético, seguidas de vórtice para os padrões restantes, Adicione uma proporção predeterminada de tampão ELISA e alíquota de amostra acetilada a um tubo de microcentrífuga. Padrão de vórtice 0. Transferir alíquotas de 50 microlitros do Padrão 0 para cinco poços designados como os poços NSB e B zero da microplaca ELISA. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão ELISA nos dois poços NSB contendo o Padrão 0. Usando uma única ponta de pipeta, adicione alíquotas de 50 microlitros dos Padrões 1 a 8 em poços duplicados, começando com o Padrão 8 e prosseguindo para o Padrão 1. Vortex cada amostra. Em seguida, adicione 50 microlitros nos poços apropriados em duplicata ou triplicata. Agora, pipete 50 microlitros de marcador de acetilcolinesterase para todos os poços designados como NSB, B zero, padrão e amostra. Adicione 50 microlitros de anti-soro a cada B nada, padrão e sample bem. Cubra a placa ELISA e incube a quatro graus Celsius por 18 horas. Após a incubação, inverta a placa ELISA sobre um recipiente de resíduos para descartar o conteúdo. Encha os poços com tampão de lavagem usando um frasco de lavagem. Agite suavemente por cinco segundos. Em seguida, despeje o tampão de lavagem e bata o líquido restante em uma toalha de papel. Agora, transfira o reagente de Ellman para um reservatório. Trabalhando rapidamente, use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microlitros de reagente de Ellman aos poços em branco, NSB, B naught, TA, padrão e amostra. Adicione cinco microlitros de marcador de acetilcolinesterase ao poço TA. Em seguida, cubra a placa ELISA com Parafilm. Coloque-o em um recipiente protegido contra luz para incubar em temperatura ambiente com agitação por 60 a 90 minutos. Remova o parafilme e leia a densidade óptica a 412 nanômetros A concentração cíclica de GMP no fígado suíno no grupo controle foi de aproximadamente 0,0202 nanomoles por grama de tecido. No grupo tratado com nitrato, a concentração de GMP cíclico aumentou para aproximadamente 0,0364 nanomoles por grama de tecido.