Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

Nossa pesquisa visa identificar e caracterizar compostos bloqueadores de transmissão e genes essenciais nos estágios sexuais de Plasmodium usando sistema de alto rendimento para apoiar novas estratégias para interromper a transmissão da malária. Este protocolo aborda a falta de métodos padronizados e de alto rendimento para identificar compostos bloqueadores de transmissão usando uma linha transgênica de P.berghei com detecção automatizada de fase de luminescência do desenvolvimento do parasita pós-fertilização. Este protocolo permite a triagem dos estágios sexuais do Plasmodium, detecta compostos bloqueadores de transmissão precoces e suporta a determinação precisa de IC50, oferecendo vantagens sobre os métodos convencionais.

Para começar, prepare as amostras compostas diluindo o estoque de composto para um milimolar usando meio oocineto. Preparar as amostras de trabalho diluindo este estoque de um milimolar em meio oocineto na proporção de um para 100 para atingir uma concentração final de 10 micromolares. Para um ensaio, prepare um volume final de 200 microlitros de amostra de trabalho em duplicata.

Se o composto for dissolvido num solvente que não seja água, preparar uma amostra de controlo diluindo o solvente no meio oocineto na mesma proporção utilizada para a amostra de ensaio. Usando duas placas de 96 poços, coloque 80 microlitros de cada amostra em poços designados para controle positivo, controle negativo, controle de solvente e amostras de teste em duplicata seguindo o layout fornecido. Adicione quatro microlitros de sangue de camundongo parasitado a cada poço na proporção de um para 20, exceto os poços de controle negativo.

Homogeneizar suavemente pipetando para cima e para baixo. Para o controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado a cada poço na proporção de um para 20 e homogeneize suavemente pipetando. Coloque as placas em uma incubadora ajustada para 21 graus Celsius e incube por seis horas ou 24 horas.

Após a incubação, homogeneizar cada amostra pipetando para cima e para baixo para garantir a mistura adequada do meio sanguíneo. Prepare o tampão de lise e a mistura de substrato de luciferase na proporção de um para 50 imediatamente antes do uso. Misture esta mistura de substrato tampão de lise com cada amostra na proporção de um para um, garantindo uma mistura suave sem introduzir bolhas.

Incube a placa a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Agora, transfira as amostras para uma placa branca de fundo plano de 96 poços e meça a luminescência usando um leitor de placas. Após o ensaio de luminescência, registre os dados brutos de luminescência exibidos pelo leitor de placas.

Usando uma planilha, calcule a média de cada medição usando a fórmula fornecida. Substitua XX pelo endereço da primeira célula de medição e YY pelo endereço da segunda célula de medição. Repita a fórmula para todas as amostras.

Converta os dados em porcentagem de inibição usando a fórmula fornecida, onde A é o valor da unidade de luz relativa da amostra e B é o valor da unidade de luz relativa de controle. Selecione compostos que apresentem mais de 95% de inibição para a determinação da concentração inibitória de 50%. Depois de infectar camundongos com Ookluc e coletar sangue parasitado, prepare amostras compostas usando meio oocineto como diluente na concentração inicial que mostrou 100% de inibição da conversão.

Pipetar as amostras em triplicado para uma placa de 96 poços seguindo o esquema especificado. Usando uma pipeta, execute diluições seriais duplas transferindo 80 microlitros do poço D1 para D2, misturando bem, depois transferindo 80 microlitros de D2 para D3 e continuando esse processo até D12. Descarte os 80 microlitros finais removidos do D12 para manter 80 microlitros por poço.

Agora, adicione sangue de camundongo parasitado a cada poço na proporção de um para 20 e homogeneize suavemente pipetando. Nos poços de controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado na proporção de um para 20 e homogeneize suavemente. Coloque a placa em uma incubadora ajustada para 21 graus Celsius e incube por seis ou 24 horas antes de realizar o ensaio de luminescência.

Depois de calcular a inibição percentual, abra o software de análise e crie uma tabela XY para plotagem. Defina o eixo y para inserir três valores replicados em subcolunas lado a lado. Cole os dados na tabela com x representando a concentração do composto e y representando a porcentagem de inibição.

Agora, clique em Analisar. Selecione Regressão não linear, ajuste de curva, escolha Curvas de dose-resposta, Inibição, seguido de Inibidor vs. resposta normalizada, inclinação variável e clique em OK. Visualize a curva dose-resposta no painel esquerdo e aplique personalizações, como alterações de cor ou formato de ponto.

Localize a tabela de ajuste não linear para encontrar o IC50 calculado e o intervalo de confiança de 95%. A pirimidina azepina 90 demonstrou uma clara inibição dependente da concentração da atividade alvo com mais de 95% de inibição observada em concentrações de 0,125 a um micromolar e perda completa de atividade abaixo de 0,007 micromolar, sugerindo um efeito de limiar acentuado em sua resposta inibitória. A curva dose-resposta ajustada aos dados de pirimidina azepina 90 produziu um valor de IC50 de 0,013 micromolar, indicando alta potência na inibição da atividade alvo.