Name: Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a identificar compostos bloqueadores de transmissão em estágios sexuais de Plasmodium usando a linha transgênica P. berghei com detecção automatizada por luminescência. Este método de triagem de alto rendimento permite determinação precisa de IC50 e oferece vantagens sobre métodos convencionais para interromper a transmissão da malária.

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Todos os experimentos em animais foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes éticas e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (CEUA-ICB/USP). Os animais foram alojados e mantidos de acordo com as normas estabelecidas por este comitê. Experimentos envolvendo parasitas Plasmodium geneticamente modificados, bem como seu armazenamento criopreservado a -80 °C, foram conduzidos de acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê Institucional de Biossegurança do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (CIBio-ICB/USP). Um total de três camundongos BALB/c fêmeas, com idades entre 3 e 5 semanas, foram usados neste estudo - dois infectados e um não infectado.
1. Materiais e reagentes
<ol>
	<li>Prepare o meio oocineto suplementando RPMI 1640 com HEPES 0,025 M, penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), 50 mg / L de hipoxantina e 100 μM de ácido xanturênico. Ajuste o pH para 8,3 8,16.</li>
	<li>Preparar a solução de trabalho para o ensaio de luminescência misturando 1 volume de substrato com 50 volumes do tampão de lise fornecido no sistema de ensaio de luciferase.</li>
	<li>Defina uma incubadora para 21 °C.</li>
</ol>
2. Infecção e coleta de sangue parasitado
<ol>
	<li>Infecte duas fêmeas de camundongos BALB/c (4-6 semanas de idade) com 150 μL de cepa Ookluc criopreservada por meio de injeção intraperitoneal (IP) (Dia 0). NOTA: Neste protocolo, recomendamos o uso de camundongos BALB/c devido à sua pronta disponibilidade e uso generalizado em biotérios. No entanto, qualquer cepa de camundongo do tipo selvagem que seja suscetível à infecção por P. berghei e suporte à gametocitogênese deve ser adequada para uso.</li>
	<li>A partir do dia 3, avalie a parasitemia e a gametocitemia por meio do exame microscópico de esfregaços de sangue corados com Giemsa.</li>
	<li>Quando a parasitemia e a gametocitemia atingirem aproximadamente 5% e 0,5%, respectivamente (geralmente no dia 4), colete sangue por punção cardíaca usando seringas heparinizadas e agrupe o sangue de ambos os camundongos infectados. NOTA: Embora esta seja uma linhagem transgênica de P. berghei, seu perfil de crescimento e gametocitemia são semelhantes aos observados na cepa ANKA. Nesse contexto, a proporção de gametócitos em relação à parasitemia total é aproximadamente 10x menor. NOTA: Idealmente, a placa composta (veja abaixo) é preparada antes da coleta do sangue parasitado, de modo que o sangue é pipetado para a placa imediatamente após a coleta. Se o sangue de camundongo precisar ser coletado em uma sala diferente, ou não puder ser imediatamente pipetado para a placa composta por qualquer outro motivo, o sangue coletado deve ser mantido a 37 ° C por não mais de 30 min.</li>
</ol>
3. Ensaio de conversão - triagem em placas de 96 poços
NOTA: Para garantir resultados consistentes, todo o experimento deve ser repetido três vezes em dias diferentes para confirmar os resultados.
<ol>
	<li>Preparar as amostras compostas utilizando o meio oocineto como diluente (uma concentração final de 10 μM). Diluir o composto a 1 mM e preparar amostras de trabalho diluindo o estoque de 1 mM 1:100 v:v em meio Ookinete. Para um ensaio em duplicado, preparar um volume final de 200 μl de amostra de trabalho.</li>
	<li>Se o composto for diluído num solvente que não seja água, incluir uma amostra de controlo que contenha o solvente diluído em meio oocineto na mesma proporção que na amostra de ensaio, a fim de garantir que qualquer inibição observada é atribuível ao composto e não ao solvente. NOTA: Como exemplo, examinaremos 90 compostos.</li>
	<li>Usando duas placas de 96 poços, coloque 80 μL das amostras em cada poço, conforme a seguir e ilustrado na Figura 1, em duplicata (duas placas): Controle positivo: 80 μL de meio oocineto; Controle negativo: 80 μL de meio oocineto; Controle de solventes: 80 μL de meio oocineto com 1% de DMSO; Amostras: 80 μL de 10 μM de cada composto em meio oocineto.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Figura 1: Representação esquemática de um layout de placa de 96 poços projetado para triagem composta. O layout da placa inclui controle positivo (C+), controle negativo (C-), controle mais solvente de diluição (C+S) e 90 compostos de teste (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Adicione 4 μL de sangue de camundongo parasitado a cada poço da placa de 96 poços na proporção de 1:20 v:v, exceto para o controle negativo (C-). Homogeneizar suavemente por pipetagem. NOTA: Considerando as perdas, calculamos a necessidade de ~400 μL de sangue parasitado para cada placa.</li>
	<li>Para o controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado na proporção de 1:20 (v: v, sangue: amostra). Homogeneizar suavemente.</li>
	<li>Incubar a 21 °C durante 6 h ou 24 h. NOTA: A atividade do nLuc é detectável com 6 h de incubação e atinge o pico às 24 h do ensaio8. O ensaio não é capaz de identificar compostos com atividade após a formação do zigoto, como compostos que inibem a morfogênese do oocineto, porque os zigotos formados acumulam nLuc independentemente de completar a morfogênese. Portanto, a incubação de 6 h é suficiente para detectar todos os compostos que bloquearão a atividade do nLuc inibindo a gametogênese, a recombinação sexual ou a citotoxicidade precoce. No entanto, normalmente favorecemos incubações de 24 h para ter sinais mais fortes e melhor relação sinal-ruído.</li>
</ol>
4. Ensaio de luminescência
<ol>
	<li>Após o período de incubação, homogeneizar as amostras pipetando para cima e para baixo para garantir uma mistura completa do meio sanguíneo.</li>
	<li>Prepare a mistura de tampão de lise/substrato de luciferase imediatamente antes de usar na proporção de 1:50 (v:v, substrato:tampão de lise).</li>
	<li>Misture a mistura de substrato com amostras na proporção de 1:1 (v:v), garantindo uma mistura suave para evitar bolhas. Incubar a 37 °C durante 3-5 min. NOTA: Neste exemplo, adicionamos 84 μL de substrato: tampão de lise a cada poço.</li>
	<li>Transfira as amostras para uma placa branca de fundo plano de 96 poços. Meça a luminescência usando um leitor de placas. Use a seguinte configuração de parâmetros: filtro de emissão: lente; tempo do intervalo de medição: 1 s por poço.</li>
</ol>
5. Análise de dados - rastreio
<ol>
	<li>Após o ensaio de luminescência, anote os dados brutos que aparecem (Figura 2). NOTA: As Unidades de Luz Relativa (RLU) obtidas dependem do luminômetro usado. Em nosso caso, os valores de RLU para o controle positivo variaram de 10.000 a 500.000 em um ensaio de incubação de 24 horas. Tempos de incubação mais curtos (6 h) resultarão em valores de RLU mais baixos.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Figura 2: Resultados obtidos a partir de uma leitura simulada de um ensaio de conversão para triagem de compostos. A imagem exibe leituras de luminescência simuladas de um ensaio realizado após a conversão de oocinetos na presença de um painel de 90 compostos. Valores mais baixos da Unidade de Luz Relativa indicam formação reduzida de ookinete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Usando uma planilha, calcule a média de cada medida usando a fórmula abaixo. Substitua XX pelo endereço da primeira célula de medição e YY pelo endereço da segunda célula de medição. Repita a fórmula para todas as amostras. =(MÉDIA(XX:AA)</li>
	<li>Converta os dados em % de inibição para uma melhor análise dos resultados. Na planilha, use a fórmula abaixo. Substitua A pelo valor de RLU de amostra e B pelo valor de RLU de controle. Repetir a fórmula para todos os compostos testados: = 1 - (A/B) x 100 NOTA: Os dados aparecerão conforme mostrado na Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Figura 3: Resultados obtidos a partir de uma leitura simulada de um ensaio de conversão para triagem de compostos representados como % de inibição para cada composto. Percentagem de inibição da conversão para cada composto ensaiado, calculada como acima descrito. Os quadrados destacados indicam compostos que promovem mais de 95% de inibição da conversão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Identifique os compostos que apresentam mais de 95% de inibição. NOTA: Esses compostos exibem alta atividade contra os estágios sexuais na concentração de 10 μM. Em nosso exemplo, encontramos cinco compostos com alta atividade contra os estágios sexuais.</li>
	<li>Para os compostos identificados, efectuar uma determinação IC50 conforme descrito a seguir.</li>
</ol>
6. Ensaio de conversão - determinação do IC 50
<ol>
	<li>Infectar camundongos com Ookluc e coletar sangue parasitado, conforme descrito na seção 2.</li>
	<li>Preparar as amostras utilizando o meio ookinete como diluente. Utilizar uma concentração inicial na qual se observe 100% de inibição da conversão pelo composto. NOTA: Como os compostos ativos foram identificados em uma tela com concentração de 10 μM, usamos 20 μM como concentração inicial para a primeira curva dose-resposta. Para uma curva dose-resposta precisa, é importante que seu ensaio inclua concentrações iniciais que resultem em 100% de inibição da conversão e concentrações finais que levem a 0% de inibição. Essa abordagem garante um cálculo preciso do IC50 . A primeira curva dose-resposta informará as concentrações mais baixas do composto com ~ 100% de inibição. Neste protocolo, usaremos o PyAz90, recentemente identificado usando o Ookluc13, como exemplo.</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços, adicione triplicata (ver Figura 4): Controle positivo (C+): 80 μL de meio oocineto; Controle negativo (C-): 80 μL de meio oocineto; Primeira diluição da amostra (Cpd D1): 160 μL de composto em uma concentração inicial em meio oocineto que resulta em 100% de inibição da conversão; Poços D2 a D12: 80 μL de meio oocineto.</li>
	<li>Faça diluições seriais duplas pipetando 80 μL do poço D1 em D2, homogeneize e pipete 80 μL do poço D2 em D3 e assim por diante. Certifique-se de que todos os poços tenham 80 μL de volume total, portanto, descarte os últimos 80 μL removidos do poço D12. NOTA: Realize o experimento com pelo menos três réplicas para todas as amostras, conforme indicado na Figura 4. Para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade de seus resultados, todo o experimento deve ser repetido em três dias separados usando animais recém-infectados a cada vez. NOTA: Se na primeira tela, os resultados não mostrarem impacto do solvente na conversão, não é necessário incluir esses controles em diluições seriadas. Caso contrário, devem também ser incluídas diluições em série do solvente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Figura 4: Layout de placa de 96 poços projetado para determinação do composto IC50 . O layout da placa inclui diluições de controle positivo (C+), controle negativo (C-) e composto (Cpd) (D1 a D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5">
	<li>Adicione sangue de camundongo parasitado à placa de 96 poços a 1:20 v:v. Homogeneizar suavemente por pipetagem. NOTA: Um total de 4 μL de sangue parasitado será adicionado a cada poço, exceto ao controle negativo (C-). Considerando as perdas, calculamos a necessidade de ~200 μL de sangue parasitado para cada composto a ser testado.</li>
	<li>Em poços de controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado na proporção de 1:20 (v: v, sangue: amostra). Homogeneizar suavemente.</li>
	<li>Incubar a 21 °C durante 6 h ou 24 h.</li>
	<li>Efectuar o ensaio de luminescência, conforme descrito no ponto 4.</li>
</ol>
7. Análise dos dados - determinação do IC 50
NOTA: IC50 é definido como a concentração de um composto necessária para inibir 50% da atividade/inibição biológica. Neste ensaio, a inibição refere-se à redução na conversão de oocineto. Os dados são representados como uma curva de dose-resposta sigmoidal, onde o eixo X representa a concentração do composto (transformada em log) e o eixo Y representa % de inibição.
<ol>
	<li>Calcule a % de inibição conforme descrito na etapa 5.3 da seção 5.</li>
	<li>Abra o software e crie uma tabela XY.</li>
	<li>Defina as opções do eixo Y como Insira 3 valores de replicação em subcolunas lado a lado.</li>
	<li>Cole os dados, com X representando a concentração do composto e Y representando % de inibição (Figura 5A).</li>
	<li>Na barra de menus, clique em Analisar e selecione Regressão não linear (ajuste da curva) e, em seguida, Curvas dose-resposta - Inibição e [inibidor] vs. resposta normalizada -- inclinação variável; clique em OK.</li>
	<li>No painel esquerdo, observe a curva dose-resposta dos dados. Aplique a personalização desejada, como alterações de cores e formatos de ponto.</li>
	<li>Localize a tabela de ajuste de Nonlin para encontrar o ICcalculado 50 e o intervalo de confiança de 95% (IC de 95%) (Figura 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
Figura 5: Curva dose-resposta de PyAz90. A % de inibição foi medida em função da concentração de PyAz90 (μM) em escala logarítmica. A curva sigmoidal representa os dados ajustados utilizados para determinar o IC50, que foi de 0,013 μM (intervalo de confiança de 95%: 0,012-0,014 μM). Os pontos de dados representam a média ± o erro padrão da média das réplicas experimentais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism versão 10.0.0 para Windows</td><td></td><td></td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts, EUA</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Científico</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Mouses</td><td>---</td><td>---</td><td>Camundongos BALB/c fêmeas, com idade entre 3 e 5 semanas</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina & menos; Estreptomicina &menos; Solução de neomicina estabilizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pág. 4083</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de Microplacas POLARStar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Científico</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido xanturênico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc: uma linha de plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

ookluc-plasmodium-berghei-line-for-identifying-transmission-blocking

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Investigações detalhadas sobre os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária são fundamentais para projetar estratégias eficazes de bloqueio de transmissão. Este protocolo demonstra como efetivamente cultivar gametocitos infecciosos e, em seguida, alimentar esses gametocitos para mosquitos para gerar estágios de mosquitos de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Cultura gametocito e infecção por mosquitos através da alimentação artificial

Usando fresagem por feixe de íons focalizado para produzir lamelas vítreas on-grid a partir de amostras biológicas congeladas por imersão para tomografia crio-eletrônica.

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Aqui descrevemos um novo método para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade celular ao Plasmodium durante a fase sanguínea da infecção. Este é um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas por linfócitos citotóxicos.

In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .

Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Aprenda a identificar compostos bloqueadores de transmissão em estágios sexuais de Plasmodium usando a linha transgênica P. berghei com detecção automatizada por luminescência. Este método de triagem de alto rendimento permite determinação precisa de IC50 e oferece vantagens sobre métodos convencionais para interromper a transmissão da malária.

Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

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