Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único
1 de agosto de 2025
Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.
Aqui, fornecemos um protocolo projetado para auxiliar na dissecção rápida do epitélio olfatório para fins de sequenciamento de célula única ou núcleo único. Nosso protocolo prioriza a velocidade e a facilidade de aprendizado e é ideal para aplicações de célula única em que o tecido é homogeneizado e a dissecção rápida é mais importante do que preservar a integridade anatômica, ao contrário dos métodos anteriores. Nosso protocolo permite a dissecção rápida e fácil do epitélio olfatório, com o objetivo de facilitar estudos de sequenciamento de células únicas e promover pesquisas sobre a base genética do sistema olfatório.
Para começar, obtenha a cabeça sem pele de um rato. Use uma tesoura fina e de ponta afiada para fazer duas incisões para quebrar os arcos zigomáticos do osso esquamosal bilateralmente, colocando uma ponta de tesoura na órbita posterior e a outra adjacente ao canal auditivo. Faça uma incisão superficial de órbita em órbita ao longo da face mais anterior do osso frontal, incisando apenas a superfície dorsal do osso frontal a uma profundidade de aproximadamente um a dois milímetros.
Agora, corte ao longo da linha média do crânio do forame magno através das suturas sagital e interfrontal até atingir a incisão interorbital feita anteriormente. Insira um par de pinças na incisão da linha média e puxe firmemente um hemisfério da abóbada craniana lateralmente. Enquanto segura o osso nasal e os dentes incisivos, use uma pinça para romper a abóbada craniana contralateral.
Permita que o cérebro, incluindo os bulbos olfativos, seja removido com o hemisfério ósseo à medida que é arrancado. Em seguida, use pinças ósseas ou Rongeurs para remover qualquer osso frontal e osso pré-maxilar remanescentes até a base dos dentes incisivos. Corte ao longo da sutura frontonasal com pinças ósseas para liberar o osso nasal da placa cribriforme.
Em seguida, use uma pinça para levantar o osso nasal da placa cribriforme para expor o epitélio olfatório. Se o osso pré-maxilar residual obstruir o epitélio olfatório dorsal, remova-o antes de prosseguir. Agora, use um par de pinças de ponta fina para prender suavemente o aspecto dorsal do septo nasal em sua junção com a placa cribriforme e puxe-o posteriormente.
O epitélio olfatório principal se libertará como uma estrutura totalmente intacta. A citometria de fluxo de imagem identificou que 53,69% de todos os eventos eram núcleos. Entre os núcleos isolados, 53,89% apresentaram alta circularidade.
Os gráficos de controle de qualidade confirmaram a qualidade consistente do sequenciamento em quatro amostras, com distribuições uniformes de contagem gênica e mitocondrial. Os genes marcadores do conjunto de dados são consistentes com muitos dos genes marcadores bem estabelecidos para cada tipo de célula.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para a dissecação e dissociação rápidas do epitélio olfativo murino, com o objetivo de facilitar o sequenciamento de RNA de núcleo único. O método prioriza a velocidade e a facilidade de execução, tornando-o adequado para aplicações em que a homogeneização do tecido é necessária.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Genômica
- Pesquisa do Sistema Olfatório
Antecedentes
- A sequenciamento de RNA de célula única e de núcleo único é essencial para compreender a diversidade celular.
- Métodos anteriores de dissecação enfatizavam a integridade anatômica, o que pode não ser ideal para certas aplicações.
- O epitélio olfativo desempenha um papel fundamental na transdução sensorial olfativa.
- Aprimorar as técnicas de dissecação pode melhorar a eficiência de estudos genéticos relacionados à olfação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo fácil de usar para a dissecção do epitélio olfativo.
- Facilitar o processamento rápido do tecido para investigações de sequenciamento de célula única.
- Estimular a pesquisa sobre os mecanismos genéticos do sistema olfativo.
Métodos Utilizados
- O método emprega a dissecação do epitélio olfativo a partir de modelos murinos.
- Este modelo biológico envolve o sistema olfativo do camundongo, enfatizando a necessidade de extração rápida.
- A remoção do osso e a manipulação cuidadosa garantem a integridade do epitélio olfativo principal.
- Os passos principais incluem incisões na abóbada craniana e a extração das estruturas olfativas.
- Controles de qualidade foram implementados para manter a qualidade consistente do sequenciamento.
Resultados Principais
- Mais da metade dos eventos coletados foram identificados como núcleos, indicando isolamento bem-sucedido.
- A alta circularidade dos núcleos sugere preservação da qualidade durante a dissecação.
- O controle de qualidade demonstrou distribuições uniformes de genes e mitocôndrias.
- Os genes marcadores alinharam-se com os parâmetros estabelecidos para tipos celulares.
Conclusões
- O estudo apresenta um avanço metodológico rápido para a dissecação do epitélio olfativo.
- Ao permitir o sequenciamento eficiente de núcleos isolados, contribui para a compreensão dos fatores genéticos na olfação.
- Este protocolo pode aprimorar a análise dos mecanismos neuronais e da plasticidade em sistemas sensoriais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Preparação rápida e reprodutível de suspensões de núcleos isolados a partir do epitélio olfativo de camundongo permite o perfil molecular de alta resolução de diversas populações neuronais e progenitoras. Este protocolo aborda um gargalo fundamental na genômica de célula única ao minimizar o tempo de extração do tecido e preservar a integridade nuclear, apoiando a validação robusta de alvos e a redução de riscos mecanicistas em fluxos de trabalho de neurociência sensorial. A abordagem aumenta a confiança preditiva em pesquisas de descoberta precoce e pesquisa translacional focadas na base genética da função olfativa e regeneração.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite testar rapidamente hipóteses sobre a expressão gênica em neurônios sensoriais olfativos e suas células progenitoras.
- Apoia a validação funcional de alvos ao preservar a qualidade nuclear para sequenciamento posterior.
- Facilita a desvinculação mecanicista de vias candidatas envolvidas na renovação de neurônios sensoriais.
- Aprimora a confiança preditiva para priorizar alvos na pesquisa do sistema sensorial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece suspensões de núcleos isolados de alta qualidade adequadas para fluxos de trabalho padronizados de sequenciamento de célula única.
- Garante reprodutibilidade e escalabilidade entre múltiplas amostras e execuções experimentais.
- Oferece saídas quantitativas, incluindo rendimento nuclear e métricas de qualidade, para avaliação de desempenho do ensaio.
- Permite avaliação confiável de alterações na expressão gênica em resposta a perturbações experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no estudo da disfunção e regeneração olfativa.
- Apóia a continuidade desde a genômica em estágio de descoberta até a validação pré-clínica de alvos moleculares.
- Reduz o risco biológico ao fornecer dados consistentes e de alta qualidade para a identificação de biomarcadores translacionais.
- Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco em portfólios de neurociência sensorial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, permitindo uma transição contínua da extração de tecido ao sequenciamento de núcleos isolados e às análises downstream.
- Biologia da Descoberta: Acelera a testagem de hipóteses e a clarificação de vias na pesquisa do sistema olfativo.
- Triagem: Fornece suspensões nucleares prontas para ensaio com métricas de qualidade validadas.
- Análises: Oferece leituras quantitativas para comparar a expressão gênica entre tipos celulares e condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para distúrbios olfativos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável para o preparo de núcleos isolados em tecidos sensoriais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e produtividade em genômica de célula única.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas em neurociência sensorial.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência técnica em dissecação rápida e isolamento de núcleos a partir de estruturas anatômicas complexas.
- Requer acesso a instrumentação especializada para processamento de tecidos e controle de qualidade (por exemplo, citometria de fluxo com imagem).
- Necessita padronização entre equipes para garantir a reprodutibilidade entre estudos e operadores.
- Pode exigir adaptação para uso com outros tipos de tecidos ou sistemas modelo com características anatômicas distintas.
- A extração focada em velocidade pode limitar aplicações nas quais a integridade anatômica é crítica.
