Name: Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Aprenda a dissecção rápida do epitélio olfatório de camundongo para sequenciamento de núcleo único. Este protocolo prioriza velocidade e facilidade, facilitando estudos genéticos do sistema olfatório.

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Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados e conduzidos em conformidade com o Baylor College of Medicine IACUC. Foram utilizados camundongos fêmeas C57BL/6J (JAX:000664). Os detalhes dos reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.
1. Dissecção do epitélio olfatório
<ol>
	<li>Comece anestesiando profundamente o mouse usando qualquer método preferido (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça firme do dedo do pé e prossiga com a perfusão transcardíaca de pelo menos 10 mL de PBS 1x gelado. Remova a pele para expor o crânio (Figura 2A). NOTA: A remoção da cabeça do corpo é opcional. Se alguém decidir remover a cabeça, recomenda-se remover a pele e outros tecidos moles ao redor do crânio antes da decapitação.</li>
	<li>Usando uma tesoura fina e de ponta afiada, faça duas incisões para quebrar os arcos zigomáticos do osso esquamosal bilateralmente, colocando uma ponta de tesoura na órbita posterior e a outra adjacente ao canal auditivo (linhas verdes na Figura 2B).</li>
	<li>Faça uma incisão rasa de órbita a órbita ao longo do aspecto mais anterior do osso frontal. Incise apenas a superfície dorsal do osso frontal (~ 1-2 mm de profundidade), tomando cuidado para não cortar nenhuma estrutura ou osso subjacente que componha a órbita (linha azul na Figura 2B). NOTA: Para obter uma incisão rasa entre as órbitas, segure a tesoura perpendicularmente ao crânio e use apenas as pontas afiadas para cortar.</li>
	<li>Corte ao longo da linha média do crânio a partir do forame magno, através das suturas sagital e interfrontal, até atingir a incisão interorbital feita no osso frontal no passo 1.3 (linha vermelha na Figura 2B).</li>
	<li>Insira um par de pinças na incisão feita ao longo da linha média do crânio e puxe firmemente um hemisfério da abóbada craniana lateralmente. Essa ação também removerá os ossos da órbita (frontal, maxilar e lacrimal), expondo os aspectos laterais dos cornetos olfatórios (Figura 2D). NOTA: Tome cuidado para não danificar inadvertidamente o OE a partir deste ponto.</li>
	<li>Segurando o osso nasal e os dentes incisivos, quebre a abóbada craniana contralateral usando uma pinça. Permita que o cérebro (incluindo os bulbos olfatórios) seja removido com o hemisfério ósseo à medida que é arrancado (Figura 1E). As únicas estruturas ósseas visíveis que devem permanecer após esta etapa são a base do crânio e os ossos ao redor do OE (Figura 2F).</li>
	<li>Usando um par de pinças ósseas ou rongeurs, remova qualquer osso frontal remanescente e osso pré-maxilar (incisivo) até a base dos dentes incisivos (Figura 2G).</li>
	<li>Use pinças ósseas para cortar ao longo da sutura frontonasal para liberar o osso nasal da placa cribriforme, tomando muito cuidado para não danificar o OE exposto subjacente ou fraturar a placa cribriforme.</li>
	<li>Levante o osso nasal da placa cribriforme usando uma pinça para expor o OE (Figura 2H). Se o osso pré-maxilar residual obscurecer o OE dorsal, remova-o antes de prosseguir (círculos pretos na Figura 1I).</li>
	<li>Usando uma pinça de ponta fina, prenda suavemente a face dorsal do septo nasal em sua junção com a placa cribriforme e puxe posteriormente (Figura 2J,K). Com resistência mínima, o epitélio olfatório principal se soltará como uma estrutura totalmente intacta (Figura 2L).</li>
	<li>Prossiga imediatamente com a dissociação OE ou congele o tecido para processamento posterior.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
Figura 2: Técnica para dissecção rápida do epitélio olfatório. (A) A cabeça do rato após a remoção do tecido mole circundante. (B) Guias codificadas por cores para incisões na abóbada craniana. (C) Aparência após incisões na abóbada craniana. (D) Remoção do primeiro hemisfério da abóbada craniana junto com a porção da órbita adjacente ao epitélio olfatório. (E) Remoção da porção contralateral da abóbada craniana junto com o cérebro. (F) A cabeça após a remoção do cérebro e da abóbada craniana. (G) Remoção do osso frontal mais anterior e da pré-maxila posterior, após a incisão na sutura frontomaxilar. (H) Remoção dos ossos nasais. (I) Os círculos pretos destacam áreas de osso pré-maxilar residual que podem ser removidas opcionalmente. (J) Colocação de fórceps para remoção do epitélio olfatório intacto. (K) Puxe posteriormente para liberar o epitélio olfatório. (L) Liberação total do epitélio olfatório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Dissociação do epitélio olfatório e isolamento de núcleo único
<ol>
	<li>Coloque um tubo C e dois tubos cônicos de 15 mL por amostra no gelo.</li>
	<li>Prepare o tampão de lise adicionando inibidor de RNAse (a uma concentração final de 0,2 U / μL) ao tampão de extração de núcleos pré-fabricados.</li>
	<li>Adicione 4 mL de BSA a 1% a cada tubo cônico de 15 mL, vórtice brevemente e descarte o excesso. Isso reveste cada um dos tubos cônicos de 15 mL com BSA para minimizar a adesão dos núcleos ao tubo.</li>
	<li>Para um OE inteiro, adicione 2 mL de tampão de lise gelada a cada tubo C.</li>
	<li>Adicione amostras OE aos tubos C. Usando uma pinça # 2, segure cada amostra sobre seu respectivo tubo C e corte-a em pedaços pequenos usando uma tesoura de ponta fina.</li>
	<li>Coloque os tubos C contendo cada amostra de cabeça para baixo nos blocos dissociadores de tecidos automatizados. Na tela do dissociador, o quadrado correspondente a cada bloco mudará de Livre para Selecionado.</li>
	<li>Pressione o ícone da pasta para alternar para a pasta Miltenyi . Usando as setas, role até o programa 4C_nuclei_1 (um programa pré-carregado dentro do dissociador). Pressione OK para aplicar o programa a cada bloco e, em seguida, pressione Iniciar para iniciar o ciclo. Remova os tubos C do dissociador imediatamente após a conclusão do ciclo. NOTA: Se possível, mantenha os tubos C gelados durante o ciclo de dissociação. É importante remover as amostras do dissociador imediatamente após a conclusão do ciclo e prosseguir com as próximas etapas do protocolo para evitar a super-lise dos núcleos.</li>
	<li>Com uma pipeta, aspirar a suspensão homogeneizada do tubo C e filtrá-la através de um filtro de 70 μm para o primeiro tubo cónico revestido com BSA. Evite aspirar os fragmentos ósseos que se acumularam na parte inferior do tubo C.</li>
	<li>Enxágue o filtro com 1 mL de 1x PBS gelado para garantir a filtragem completa.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão filtrada a 500 × g durante 5 min a 4 °C numa centrifugadora de balde oscilante.</li>
	<li>Aspire e descarte suavemente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Ressuspenda completamente o pellet de núcleos em 1 mL de 1x PBS gelado por pipetagem suave.</li>
	<li>Passe os núcleos ressuspensos através de um filtro de 30 μm para o segundo tubo cônico revestido com BSA. A concentração de núcleos pode ser quantificada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.</li>
	<li>Prossiga imediatamente com o protocolo downstream escolhido (com ou sem FACS) para preservar a integridade da amostra e evitar a degradação (Figura 3). NOTA: É altamente recomendável que os usuários realizem execuções práticas de todo esse protocolo para garantir uma conclusão perfeita e oportuna.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
Figura 3: Dissociação do epitélio olfatório e fluxo de trabalho de isolamento de núcleo único. Após a dissecção, o epitélio olfatório é mecanicamente e quimicamente dissociado. O lisado é então filtrado através de um filtro de 70 μm, enxaguado com 1x PBS e centrifugado a 500 × g por 5 min. O pellet é ressuspenso em 1x PBS antes de ser filtrado através de um filtro de 30 μm. A suspensão de núcleos resultante está disponível para várias aplicações de sequenciamento a jusante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
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<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

O epitélio olfatório murino (OE) é um componente essencial do sistema olfatório e é responsável por detectar e transduzir sinais de odor para o sistema nervoso central. Sua camada mais superficial contém os cílios detectores de odor dos neurônios sensoriais olfatórios, que são recobertos por uma camada de mucosa e circundados pelas células sustentaculares e microvilaresde suporte 1,2. Os OSNs são bipolares, estendendo seus cílios apicalmente para formar uma rede dentro da camada de muco e seus axônios basalmente através da placa cribriforme óssea para coalescer em glomérulos dentro do bulbo olfatório. Esses glomérulos são o local das sinapses entre os OSNs e os neurônios a jusante. Subjacentes aos OSNs, as células progenitoras neuronais chamadas células basais globosas reabastecem constantemente os OSNs à medida que morrem3 após exposição direta a insultos ambientais, como toxinas transportadas pelo ar, patógenos e traumas físicos. As células basais globosas são derivadas de um pool de reserva de células basais horizontais multipotentes 4,5, localizadas mais basalmente e aderentes à lâmina basal de protuberâncias ósseas chamadas cornetos nasais. Os cornetos nasais são tortuosos, tornando o OE difícil de separar e homogeneizar. Além disso, o OE é cercado por ossos do crânio, dificultando o acesso à área e tradicionalmente exigindo um procedimento demorado.
Estudos anteriores contaram com uma incubação prolongada de papaína para liberar o epitélio olfatório do osso 6,7,8,9,10, o que pode atrasar ainda mais o processamento a jusante da suspensão unicelular. Como o cisalhamento dos axônios OSN desencadeia a apoptose11, é imperativo minimizar a quantidade de tempo desde a extração do tecido até a preparação da biblioteca de cDNA. Além disso, a arquitetura do OE e suas projeções para o bulbo olfatório complicam a extração de células intactas para o sequenciamento bem-sucedido de RNA de célula única. Felizmente, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) emergiu como uma ferramenta poderosa para traçar o perfil das células, preservando a distribuição do tipo de célula, particularmente em tecidos onde a dissociação de uma única célula é difícil ou impraticável12,13.
Embora vários estudos 6,7,8,10,14,15 tenham realizado o sequenciamento de célula única do OE de camundongo, nenhum oferece um procedimento de dissecção detalhado otimizado para coleta de tecido consistente e conveniente, o que é necessário dada a fragilidade do OE e o invólucro por vários ossos do crânio. Além disso, os guias de dissecção existentes16 estão focados em preservar a estrutura anatômica em vez da velocidade, levando a tempos de dissecção potencialmente longos. Como a preparação rápida do tecido é essencial para minimizar a degradação do RNA e maximizar a qualidade dos núcleos preparados17,18, é necessário um protocolo otimizado para a rápida dissecção e homogeneização do OE murino em uma suspensão de núcleo único para uso em várias aplicações a jusante.
Este protocolo (Figura 1) apresenta um método simplificado projetado para superar esses desafios, permitindo a rápida dissecção do OE murino e a dissociação eficiente do tecido com o objetivo de isolar os núcleos. Essa abordagem facilita o sequenciamento de núcleo único de alta qualidade19, fornecendo uma técnica confiável para investigar os fundamentos moleculares da biologia olfativa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
Figura 1: Anatomia das suturas e ossos relevantes do crânio de camundongo C57BL / 6 e seção transversal representativa do epitélio olfatório. (A) As suturas do crânio são codificadas por cores. As suturas são codificadas por cores em um lado do crânio, enquanto o outro lado é deixado sem marcação para referência (esquerda). Os nomes das suturas são codificados por cores de acordo (à direita). (B) Ossos do crânio codificados por cores. Os ossos são codificados por cores em um lado do crânio, enquanto o outro lado é deixado sem marcação para referência (esquerda). Nomes dos ossos codificados por cores de acordo (à direita). (C) Seção transversal da porção central do OE (dissecada usando o método descrito neste artigo) com cornetos codificados por cores em um lado e a esquerda não marcada para referência (esquerda). Nomes dos cornetos visualizados (à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Tratamento de células</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Alicate de Osso</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris Miniatura Bonn&nbsp;</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Resposta A1595</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #3&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J fêmeas</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Tubos C gentleMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 30 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 70 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Micro Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Extração de Núcleos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x sem cálcio e magnésio, PH 7,4 &plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNAse Protetora</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Refrigerada Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Científico</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

Para fornecer contexto anatômico para dissecção e análise, as suturas e ossos do crânio de camundongo C57BL/6, bem como a porção central do epitélio olfatório (OE), foram visualizados e codificados por cores (Figura 1). Um lado de cada imagem foi anotado para destacar suturas, ossos e cornetos relevantes, enquanto o outro lado foi deixado sem marcação para referência. A seção transversal do OE foi preparada seguindo protocolos estabelecidos20, e a identificação dos co...

Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

O vídeo demonstra o isolamento de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo transgênico. O embrião expressa neurônios motores marcados com uma proteína fluorescente verde (GFP) para fácil visualização e identificação. Os neurônios motores são isolados cirurgicamente sob um microscópio de fluorescência e mantidos em meio de cultura.

Isolamento e cultura de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo

Este vídeo demonstra um método para isolar células oligodendrócitos primárias de uma suspensão de células neurais obtida de um filhote de camundongo usando separação magnética. A técnica emprega esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos para antígenos de oligodendrócitos, permitindo o isolamento seletivo dessas células.

Isolando oligodendrócitos primários murinos usando grânulos imunomagnéticos

Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

Os cílios dos neurônios sensoriais olfatórios contêm proteínas da cascata de transdução de sinal, mas uma análise espacial detalhada de sua distribuição é difícil em criossecções. Descrevemos aqui uma abordagem otimizada para marcação de montagem inteira e visualização em face de proteínas ciliares.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Um método de microdisseção do oviduto do camundongo que permite a coleta dos segmentos individuais, mantendo a integridade do RNA, é apresentado. Além disso, é descrito o procedimento de dissociação de células oviducais não enzimáticas. Os métodos são apropriados para análise genética e proteica subsequente dos segmentos oviductais funcionalmente diferentes e células oviductais dissociadas.

Microdisseção e Dissociação do Ovídeo Murine: Identificação do Segmento Individual e Isolamento de Célula Única

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Aprenda a dissecção rápida do epitélio olfatório de camundongo para sequenciamento de núcleo único. Este protocolo prioriza velocidade e facilidade, facilitando estudos genéticos do sistema olfatório.

Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

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