Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Um protocolo baseado em fluorescência para triagem preliminar de inibidores de síntese proteica de fontes naturais. A síntese de proteínas envolve processos altamente regulados, transcrição e tradução. A transcrição é regulada principalmente por fatores de transcrição, modificações da cromatina e RNAs reguladores.

Enquanto a translação é regulada por fatores de iniciação, vias de sinalização e mecanismos de estabilidade do RNA. Esses sistemas reguladores permitem que as células mantenham as funções celulares e respondam efetivamente ao estresse ou dano. As células cancerígenas desregulam a síntese de proteínas ao sequestrar a maquinaria translacional para sustentar suas altas demandas energéticas e crescimento descontrolado.

Essa reprogramação é resultado da desregulação de quase todas as principais vias de sinalização oncogênica, promovendo a sobrevivência, proliferação e metástase celular, enquanto suprime as vias de morte celular. Como essa síntese aprimorada de proteínas é crucial para a sobrevivência ao câncer, tratamentos que visam e bloqueiam esse processo mostram potencial como terapias potenciais. Para identificar inibidores de síntese de proteínas, pode ser utilizado o seguinte ensaio de fluorescência por inibição da síntese proteica.

Antes de iniciar o experimento, para obter resultados confiáveis, os compostos devem ser administrados em uma concentração apropriada abaixo do seu limiar de toxicidade. Para estabelecer uma concentração inicial, deve ser realizado um ensaio de citotoxicidade para determinar a CE 50 do composto. Se isso não for viável, os compostos deste ensaio podem ser testados de forma dependente da dose para determinar os parâmetros de concentração mais eficazes.

Se a concentração dos compostos desencadear a morte celular, testes em concentrações reduzidas tornam-se necessários. Também é importante proteger os corantes da luz o tempo todo quando não estiverem em uso. A exposição prolongada à luz resultará em fotobranqueamento, o que compromete a qualidade dos dados.

Passo 3.1, prepare a mistura mestre A, rotule um tubo de centrífuga como A, depois pipete 598,5 microlitros de meio de cultura e 1,5 microlitros de rótula proteica em A. Resuspenda essa mistura para garantir homogeneidade pipetando para cima e para baixo. Agora prepare a mistura master B. Rotule um tubo de centrífuga como B, depois pipete 1,5 microlitros de marcador proteico, 6,6 microlitros de cicloheximida e 591,9 microlitros de meio de cultura em B. Resuspenda essa mistura para garantir homogeneidade pipetando para cima e para baixo. Após pipetar um microlitro de composto de teste e um microlitro de veículo em dois poços, pipetee suavemente 99 microlitros de mistura mestra A em ambos os poços, pipeteando em ângulo para a lateral do poço para evitar a interrupção cinética das células.

Pipete 100 microlitros de mistura master B em dois poços não tratados. Pipete em ângulo para a lateral do poço para evitar a perturbação cinética das células. Bata suavemente na placa para conseguir a incorporação completa dos componentes desejados nas células.

Incube as células a 37 graus Celsius por 30 minutos a duas horas. Remova o meio de cultura celular por aspiração. Incline a placa e aspire na lateral do poço em vez do centro para evitar distúrbios cinéticos das células.

Depois, adicione 100 microlitros de buffer PBS em cada poço e centrifuge a placa a 900g por cinco minutos. Após a centrifugação, lembre-se de remover o buffer PBS por aspiração. Passo cinco: fixação e permeabilização.

Adicione 100 microlitros de solução fixativa a cada poço. Depois, incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos em um ambiente escuro. Depois, aspire as células.

Lave as células com 100 microlitros de tampão de lavagem e remova por aspiração. Repita isso duas vezes. Adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização a cada poço.

Depois disso, incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o tampão de permeabilização por aspiração. Passo seis, reação e coloração de proteínas.

Prepare a mistura master cocktail de reação. Adicione 651 microlitros de buffer PBS a um tubo de centrífuga. Depois, adicione sete microlitros de reagente de cobre 100x.

Depois, sete microlitros de azida fluorescente. E, por fim, adicione 35 microlitros de agente redutor ao tubo da centrífuga. Siga exatamente essa ordem ao adicionar os reagentes e depois adicione 100 microlitros do coquetel de reação a cada poço.

Incube as células por 30 minutos em um ambiente escuro, em temperatura ambiente, para evitar o fotoclareamento. Centrifuge as células a 900g por cinco minutos. Aspire, lave as células e depois aspire novamente.

Prepare uma diluição 1x da coloração total de DNA e adicione 100 microlitros a cada poço. Incube as células em temperatura ambiente por 20 minutos em um ambiente escuro para evitar o fotobranqueamento. Centrifuge a placa a 900g por cinco minutos.

Lave as células com 100 microlitros de tampão de lavagem, remova por aspiração. Repita essa etapa duas vezes. Por fim, ressuspenda as células com 100 microlitros de buffer PBS resfriado para prepará-las para a imagem.

Passo oito, imagem. Insira a placa no leitor de placas e ajuste a ampliação para 20 x. Analise a coloração do núcleo com o canal GFP 469/525 nanômetros.

Use auto-flexão e autofoco para melhorar os resultados de imagem. Analise a síntese ativa de proteínas com o canal Texas Red 586/647 nanômetros. Use auto-flexão e autofoco para melhorar os resultados de imagem.

Sondas fluorescentes são sensíveis à fotobranqueamento, que é um fenômeno em que uma radiação com luz faz com que os fluoróforos percam suas propriedades fluorescentes. Os corantes devem ser protegidos da luz o tempo todo quando não estiverem em uso. Além disso, o número de varreduras dentro de cada poço e o tempo sob luz irradiada precisam ser limitados.

A exposição prolongada à luz resultará em descolorimento fotográfico, o que, em última análise, leva a uma qualidade dos dados comprometida. Vamos analisar os resultados representativos. Células vivas aqui são vistas em verde e a síntese ativa de proteínas é indicada por vermelho.

O inibidor da síntese de proteínas cicloheximida conhecido resulta em uma grande diminuição na síntese proteica, como visto na figura 1B, em comparação com o DMSO controle negativo na figura 1A, onde há menos luz fluorescente vermelha emitida. O tratamento com composto um, como visto na figura 1C, resultou em descolamento ou morte celular. Portanto, não podemos fazer afirmações definitivas sobre sua atividade de inibição da síntese proteica.

Isso justifica estudos adicionais de resposta à dose para tentar determinar se inibe a síntese de proteínas em concentrações mais baixas. O composto dois apresenta inibição moderada da síntese proteica, conforme indicado na figura 1D. Esse ensaio fluorométrico é uma ferramenta valiosa de pesquisa e um método acessível de biologia química para treinar estudantes de graduação.

Ao fornecer um protocolo acessível e eficiente, com processamento mínimo de dados, proporciona aos estudantes experiência prática e técnicas modernas de descoberta de medicamentos, além de acelerar o processo de descoberta. O protocolo emprega substrato fluorescente e técnicas avançadas de microscopia fluorescente para detectar e medir sistematicamente as capacidades inibitórias dos compostos naturais um e dois. Usando cicloheximida como inibidor de referência, ambos os produtos naturais apresentaram níveis variados de inibição da síntese proteica.

À medida que a demanda por novos inibidores de síntese de proteínas cresce, essa abordagem oferece aos graduandos oportunidades significativas de pesquisa, ao mesmo tempo em que contribui para avanços em terapias contra o câncer.