Name: Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-15T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a isolar retinas de camundongos para estudos ex vivo de neuroinflamação no glaucoma. Este protocolo preserva o ambiente natural das células gliais, permitindo investigações mais precisas sobre astrocitos e microglia.

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Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Schepens Eye Research Institute (Protocolo # 2022N000030, aprovado em 04/03/2025). Os animais foram manuseados de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual.
NOTA: A Figura 1 mostra as principais etapas no isolamento da retina viva do olho do camundongo enucleado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68482/68482fig1.jpg"> 
Figura 1: Uma representação diagramática das principais etapas no isolamento da retina viva do olho do camundongo enucleado. Os números das etapas correspondentes das etapas principais são fornecidos em círculos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68482/68482fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparação
<ol>
	<li>Desinfete uma pipeta de 1 mL e um par de pinças angulares e coloque-as no gabinete de biossegurança. Estes serão necessários na seção 3 do protocolo.</li>
	<li>Modifique uma pipeta de transferência cortando perpendicularmente ao longo do eixo aproximadamente 2 cm abaixo do reservatório, onde o furo é mais largo, para encurtar a pipeta e alargar a abertura. Garanta um corte limpo no qual a retina não se prenda. NOTA: Esta ferramenta pode ser guardada para reutilização se estiver limpa e enxaguada com água estéril entre os usos.</li>
	<li>Prepare 50 ml de meio de explante assepticamente em um gabinete de biossegurança, suplementando 47,5 mL de meio neurobasal com 500 μL de suplemento N-2, 1 mL de suplemento B-27, 500 μL de Glutamax e 500 μL de mistura de penicilina-estreptomicina (concentração final de 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina). NOTA: Prepare um meio de explante fresco para cada série de isolamentos; o excesso de mídia pode ser mantido a 4 °C por até 1 semana e usado para trocas de mídia, se necessário. Após a abertura, substitua o meio neurobasal não utilizado após 1 mês. N-2 e B-27 devem ser mantidos congelados como alíquotas de uso único, evitando ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
	<li>Em um gabinete de biossegurança, prepare assepticamente a(s) placa(s) de cultura adicionando um inserto em cada poço a ser usado, manuseando através dos 'pinos' que emergem da borda do inserto para evitar tocar em superfícies que entrarão em contato com os meios de cultura.<ol>
		<li>Adicione 1 mL de meio de explante à inserção, seguido por mais 3 mL adicionados ao próprio poço. Adicione 2-3 mL de água estéril a quaisquer poços não utilizados para controlar a evaporação.</li>
		<li>Transfira a(s) placa(s) para a incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para equilibrar aproximadamente 30 min antes do isolamento do tecido.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare quadrados de filtro para criar um substrato para estabilização e transferência de tecidos. Extraia o filtro de um kit de filtragem de tampa de garrafa cortando a periferia do material com uma navalha ou bisturi. Tome cuidado para evitar ferimentos ou danos ao filtro por dobras ou rasgos. NOTA: Remover o reservatório de plástico transparente usando uma navalha resistente para cortar o plástico opaco mais maleável onde o adaptador rosqueado encontra o reservatório simplifica o processo de extração, mas deve-se ter cuidado adicional para evitar ferimentos.<ol>
		<li>Depois que o filtro for destacado por corte, use uma pinça para extraí-lo. Observe a orientação do filtro durante e após a extração; O lado fosco (voltado para o reservatório) deve estar na vertical para montar a retina na etapa 2.16 para transferência.</li>
		<li>Corte o filtro em pequenos quadrados de aproximadamente 7 mm × 7 mm; Cada explante de retina exigirá um quadrado. Mergulhe previamente os quadrados em água estéril em uma placa de Petri de 100 mm por pelo menos 20 min. NOTA: Os quadrados do filtro podem permanecer imersos em água estéril por até 1 semana antes do uso. Devido à tendência dos quadrados do filtro de desenvolver altos níveis de carga estática antes da imersão, prepare apenas quantos quadrados forem necessários. O material filtrante seco restante pode ser mantido indefinidamente em uma placa de Petri estéril de 100 mm para uso posterior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Isolamento e montagem
<ol>
	<li>Eutanasiar o camundongo por meio de um método aprovado antes de confirmar com uma abordagem secundária; este estudo utilizou asfixia por CO2 seguida de luxação cervical. Enuclee ambos os olhos com pinças curvas de ponta romba e coloque-os em PBS estéril.</li>
	<li>Prepare o espaço de trabalho enchendo uma placa de Petri de 100 mm com PBS estéril e colocando-a no palco do escopo de dissecção binocular.<ol>
		<li>Corte uma tira de 1 cm de largura de lenço umedecido e mergulhe-a no prato para atuar como substrato estabilizador.</li>
		<li>Transfira um olho para a placa de dissecação, deixe o outro em PBS e coloque no gelo ou na geladeira a 4 ° C. NOTA: Devido à sensibilidade da retina ao intervalo post-mortem prolongado, recomenda-se a eutanásia de um camundongo de cada vez.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posicione e imobilize o olho. Use uma pinça para manobrar o olho no lenço submerso, o que ajudará na estabilização.<ol>
		<li>Identifique um ponto de fixação apropriado, segure-o com uma pinça angular e role suavemente o olho para que seja segurado de lado ou, idealmente, de baixo. Certifique-se de que o eixo ântero-posterior (ou seja, da córnea ao nervo óptico) esteja na horizontal. Essa orientação melhora a visibilidade e minimiza a pressão sobre o olho durante a dissecção. NOTA: Se possível, segure o tecido extraorbital para evitar perfurar ou apertar o olho, favorecendo o músculo ou a conjuntiva em detrimento do nervo óptico ou da gordura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enquanto mantém uma posição segura com a pinça angular, certifique-se de que o olho esteja totalmente submerso e imobilizado com segurança. Faça uma incisão com a ponta do bisturi #11 paralela e aproximadamente 0,5 mm posterior ao limbo, onde a córnea faz a transição para a esclera. NOTA: Esta incisão deve ser grande o suficiente para caber na ponta de uma lâmina da tesoura de mola. Como a nitidez da ponta do bisturi é essencial para perfurar o globo de forma limpa, troque a lâmina a cada duas retinas.<ol>
		<li>Insira uma lâmina da tesoura de mola dentro do globo e comece a cortar circunlimbalmente ao redor do olho, reposicionando suavemente o olho conforme necessário usando uma pinça. NOTA: Este corte deve ser o mais reto e paralelo possível ao limbo; O reposicionamento do olho pode exigir largar a tesoura e usar um par de pinças com cada mão. Uma vez exposta, mantenha a retina submersa durante toda a dissecção.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depois que o corte circunscrever o olho, remova cuidadosamente o segmento anterior e a lente e, em seguida, gire a ocular para cima para facilitar a inspeção visual e a remoção do vítreo. Se um pedaço estendido de nervo óptico permanecer preso, corte-o em um comprimento menor (1-2 mm) para facilitar isso.</li>
	<li>Inspecione a retina em busca de danos visíveis e a câmara vítrea em busca de detritos, como células pigmentadas do EPR ou coróide que podem ter entrado durante a remoção do segmento anterior. Use uma pinça angular para imobilizar a ocular nesta posição. NOTA: Para obter os melhores resultados, os detritos na câmara vítrea devem ser removidos e os restos vítreos e aderentes residuais do corpo ciliar na periferia da retina devem ser minimizados. Este pode ser um processo desafiador, e notas adicionais podem ser encontradas nas seções 'Reconhecendo e solucionando problemas de lesões mecânicas' e 'Lesões metabólicas' dos Resultados Representativos.<ol>
		<li>Use a pipeta de transferência modificada para lavar a câmara vítrea com PBS para remover pequenos detritos particulados, evitando bolhas de ar, mantendo a ponta da pipeta abaixo da superfície do líquido e mantendo uma quantidade adequada de PBS no bulbo do reservatório.</li>
		<li>Remova os detritos maiores com um pincel fino de aquarela, minimizando o contato com a superfície da retina. Se necessário, remova os detritos mais persistentes com pinças de ponta fina; no entanto, evite o contato direto das pontas das ferramentas de metal com a retina para evitar danos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depois de limpar os detritos visíveis, lave a câmara vítrea com PBS da pipeta de transferência repetidamente (3-5 vezes), conforme descrito acima. Isso removerá o vítreo frouxamente aderente que pode permanecer após a remoção dos detritos. Use a escova fina para sondar suavemente a câmara, principalmente perto da periferia, se os elementos do corpo ciliar permanecerem. Embora o vítreo seja opticamente transparente, ele atuará como um arrasto nas fibras da escova e pode ser detectado dessa maneira. NOTA: Uma fina camada residual de vítreo na retina não parece afetar negativamente o isolamento ou manter a retina ex vivo, mas a presença de quantidades significativas na periferia da retina, muitas vezes associada a estruturas residuais do corpo ciliar, pode causar dobramento da retina e perda de amostra se não for removida.<ol>
		<li>Se permanecerem bolsas significativas de vítreo, use a escova para removê-lo varrendo suavemente para fora em direção à periferia, garantindo que, se as fibras da escova entrarem em contato com a retina, elas o façam de um ângulo raso e rastreiem a escova, puxando em vez de empurrar o vítreo da câmara. NOTA: A remoção do vítreo requer um manuseio particularmente cuidadoso para evitar danos à retina que podem não ser visíveis macroscopicamente; conselhos sobre como reconhecer e evitar esses danos são encontrados nas seções 'Reconhecendo e solucionando problemas de lesões mecânicas' e 'Lesões metabólicas' dos Resultados Representativos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uma vez que a câmara vítrea tenha sido limpa de detritos e apenas o mínimo de vítreo permaneça, separe suavemente a retina externa da ocular enquanto continua a estabilizar a amostra com uma pinça angular. Evite danificar a cabeça do nervo óptico e deixe essa estrutura intacta para ancorar a retina.<ol>
		<li>Pegue uma pinça, mantendo-a na posição fechada com as pontas se tocando, e insira-a suavemente entre a retina e a coroide, usando uma lacuna pré-existente do manuseio anterior, se possível. Use os braços planos da pinça, em vez das pontas, para aumentar a bolsa entre a retina e a coróide até que essas estruturas possam ser completamente separadas. NOTA: Enfatize os movimentos laterais, em vez de empurrar as pontas, para expandir o espaço entre a retina e a coroide. Torcer suavemente a pinça durante esses movimentos pode melhorar a separação, reduzindo o estresse absoluto do atrito entre a pinça e o tecido.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depois de separar a retina externa da coroide, continue estabilizando a amostra enquanto usa um segundo par de pinças para puxar a ocular - esclera, coróide, etc. - para baixo. Se a retina foi separada com sucesso, ela deve permanecer no lugar, amarrada na cabeça do nervo óptico, enquanto a ocular pode ser mantida por um único par de pinças. Se a retina pressionar com a ocular, continue sondando e separando suavemente os pontos de conexão que não sejam a cabeça do nervo óptico.</li>
	<li>Com a retina ancorada na cabeça do nervo óptico, continue imobilizando o tecido e use o segundo par de pinças para agrupar a ocular abaixo da cabeça do nervo óptico.<ol>
		<li>Verifique se nenhuma parte da periferia da retina está presa em uma posição dobrada devido ao excesso de vítreo no ângulo entre a retina e qualquer corpo ciliar residual. Se necessário, lave a câmara com PBS usando a pipeta de transferência para remover quaisquer detritos adicionais e use suavemente a escova para desenrolar o tecido e eliminar o excesso de vítreo, tomando cuidado para não puxar o tecido excessivamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Com a retina exposta de ambos os lados, use a tesoura de mola para fazer uma série de cortes de alívio, espaçados aproximadamente 90°, estendendo-se em linha reta da periferia em direção à cabeça do nervo óptico, parando a aproximadamente 1 mm do centro. Isso minimiza a transecção dos axônios das células ganglionares da retina na retina, melhorando a qualidade dos explantes cultivados.</li>
	<li>Enquanto segura o tecido submerso no lugar, remova suavemente o lenço umedecido usando uma pinça para puxá-lo para longe do tecido lateralmente antes de removê-lo do prato. Evite o contato com a retina para evitar a adesão ao lenço e possível perda de amostra.</li>
	<li>Em seguida, continue a segurar o tecido e use a tesoura de mola para cortar o nervo óptico diretamente abaixo da retina e, em seguida, remova o restante da ocular do prato.</li>
	<li>Uma vez que a retina esteja isolada do resto do olho, encha uma placa de Petri de 35 mm com PBS e use uma pinça para colocar um quadrado de filtro na parte inferior com o lado fosco mais áspero voltado para cima. Tome cuidado para evitar vincar o filtro, pois isso pode impedir o uso do filtro como substrato para mover a retina.</li>
	<li>Aspire suavemente a retina com a pipeta de transferência e transfira-a cuidadosamente para a placa de 35 mm. Manobre a retina com a escova para garantir que a superfície interna da retina esteja na vertical e que o tecido fique diretamente acima do quadrado do filtro.</li>
	<li>Aspire lentamente o PBS do prato com a pipeta de transferência para abaixar a retina no filtro. Pausa, se necessário, para reajustar o tecido antes de continuar até que a retina se acomode no filtro. NOTA: A aspiração rápida pode levar a um movimento lateral repentino da retina, resultando em danos ou perda de tecido. Toda a retina deve repousar no quadrado para evitar danos; no entanto, se a retina se acomodar em uma posição problemática, o PBS pode ser adicionado de volta ao prato até que a retina seja ressuspensa e a montagem possa ser tentada novamente.</li>
	<li>Depois que a retina se acomodar no filtro, use o pincel para desenrolar qualquer retina periférica que possa ter se dobrado. Equilibre cuidadosamente o nível de PBS para que a retina não se mova facilmente do filtro, garantindo que reste o suficiente para que a amostra não seque e a escova possa se mover suavemente sem danificar a retina interna.</li>
	<li>Mais uma vez, inspecione a retina em busca de detritos. Para evitar danos, limpe a retina sem manuseio direto usando a pipeta de transferência para pingar PBS na retina a cerca de 1 cm acima do tecido. Isso deve remover quaisquer detritos restantes, mas se muito PBS for adicionado ao prato, a retina pode flutuar de volta. Se isso ocorrer, realize a aspiração novamente para remontar o tecido. NOTA: Amostras 'simuladas' podem ser geradas transferindo retinas para uma placa de 24 poços para fixação, bloqueio/permeabilização e coloração de anticorpos, conforme descrito em outro lugar21. Esses controles simulados são úteis para solucionar problemas de lesões mecânicas na retina que podem ocorrer durante o isolamento.</li>
</ol>
3. Transferência para meios de cultura e manutenção
<ol>
	<li>Feche a tampa do prato de 35 mm para transporte até o gabinete de biossegurança, mantendo o prato nivelado para evitar o deslocamento da retina do filtro. Se isso ocorrer, remonte como acima.</li>
	<li>Coloque o prato fechado de 35 mm contendo a retina no gabinete de biossegurança, tomando cuidado para não tocar em nenhum equipamento ou superfície dentro do gabinete antes de desinfetar ou trocar as luvas.</li>
	<li>Descontamine as luvas com etanol e/ou substitua-as e, em seguida, mova a placa de 6 poços pré-carregada com meio de explante da incubadora para o gabinete de biossegurança. Execute as etapas 3.4 e 3.5 dentro do gabinete de biossegurança, usando as ferramentas colocadas durante a etapa 1.1.</li>
	<li>Remova a tampa do prato de 35 mm que contém a retina e use uma pinça angular para levantar cuidadosamente o quadrado do filtro sem tocar diretamente na retina. Remova a tampa da placa de 6 poços e posicione o filtro sobre o centro da inserção de um poço apropriado e, em seguida, abaixe-o lentamente na mídia. A retina se desprenderá do filtro durante esta etapa e flutuará logo abaixo da interface ar-líquido.</li>
	<li>Depois que a retina e o filtro se separarem, afaste lentamente o filtro da retina e remova-o da mídia. Usando a pipeta de 1 mL, remova 500 μL de mídia do inserto para garantir que a retina fique plana, prendendo-a entre o piso do inserto e a interface ar-líquido.</li>
	<li>Recoloque a tampa da placa e devolva-a à incubadora a 37 °C com 5% de CO2, tomando cuidado para manter a retina próxima ao centro do poço. Até 6 retinas podem ser mantidas em uma única placa. NOTA: Se mantiver explantes por 24 h ou menos, eles podem ser deixados na incubadora até o final do experimento. Se mantido por períodos mais longos, recomenda-se 50% de mudanças de meio após 1 dia in vitro e em dias alternados a partir de então.</li>
</ol>
4. Fixação para imunomarcação (opcional)
<ol>
	<li>Se estiver realizando imunocoloração, consulte as etapas a seguir para fixação; Embora a imunomarcação possa ser realizada usando parâmetros previamente detalhados para retinas planas21, a fixação da retina explantada requer considerações específicas.</li>
	<li>Remova as inserções de cultura de células com explantes e meios da placa de cultura de 6 poços e coloque-as em uma superfície não porosa (como a tampa plástica da placa de cultura) que possa ser descartada adequadamente após a fixação, pois as inserções são ligeiramente porosas e pequenas quantidades de fixador passarão para esta superfície subjacente.</li>
	<li>Remova suavemente os meios de cultura das inserções e, em seguida, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) a cada um. Deixe as retinas fixarem por 15 minutos em uma capela e, em seguida, remova o PFA e descarte-o de acordo com a política institucional. CUIDADO: O paraformaldeído é perigoso e um precursor do formaldeído, um conhecido agente cancerígeno. Tenha cuidado e efetue a fixação em uma hotte com as devidas precauções.</li>
	<li>Lave as retinas 3 vezes (por 5 min cada) com PBS para remover o PFA e, em seguida, use uma pipeta de transferência modificada para transferir as retinas em PBS para poços individuais em uma placa de 24 poços para bloqueio, permeabilização e imunocoloração, conforme descrito em outro lugar21. Descarte os plásticos contaminados com PFA (pontas de pipeta, inserções e a superfície não porosa usada durante a fixação) de acordo com a política institucional. NOTA: A pipeta de transferência pode ser mantida para transferir retinas fixas e manchadas para uma lâmina para montagem e imagem. Embora não deva ter tido contato direto com o PFA, recomenda-se o uso de pipetas de transferência diferentes para o manuseio de tecidos vivos e fixos.</li>
</ol>

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<li>Yu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+target+synaptic+sites+early+during+excitatory+circuit+disassembly+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration.</a> iScience. 28 (4), 112201(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#11 Lâminas de bisturi</td><td>Bard-Parker</td><td>3,71,311</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 1 mL ('Pipetman P1000')</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Ted Pella Inc</td><td>18,505</td><td>Diluído a 4% para fixação</td></tr><tr><td>24 Placa</td><td>de Poço Falcon</td><td>353047</td><td>Para fixação, bloqueio e incubação de anticorpos</td></tr><tr><td>35 mm placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>kit de placa e inserção de 6 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>657641</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>711-545-152</td><td>diluição 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG anti-rato para burro (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21209</td> altamente adsorvido 1<td>:800 diluição Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 594-F(ab')2 IgG anti-rato para burro (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>715-586-150</td><td>diluição 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>706-605-148</td><td>diluição 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-F(ab')2 IgY Anti-Frango para Burros (IgG) (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>703-606-155</td><td>Diluição 1:800</td></tr><tr><td>Pinça angular ('5/45')</td><td>FST / Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Brn3a (camundongo)</td><td>Chemicon</td><td>MAB1585</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD206 (rato)</td><td>Biorad</td><td>MCA2235</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP (frango)</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 anticorpo (coelho)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>019-19741</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Tmem119 (cobaia)</td><td>Synaptic Systems</td><td>400 004</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>B-27, 50x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva romba ('Extra Fine Graefe)</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Use 1% p/v para bloqueio e incubação de anticorpos</td></tr><tr><td>Kit de filtro (0.2 &micro; membrana m aPES, Filtro Superior de Garrafa de 150 mL)&nbsp;</td>Pincel <td>Fino FB12566508</td><td></td> <td>FisherScientific</td></tr><tr><td>, Tamanho 3/0</td><td>Princeton Art & Brush Co.</td><td>06435-1030</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de laboratório (toalhetes Kim)&nbsp;</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>N-2, 100x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium, menos fenol vermelho</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>12349015</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro Normal</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td>Use a 10% para bloqueio e incubação de anticorpos</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta, 1000 &micro; L</td><td>TipOne</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola ('Cohan-Vannas')</td><td>FST</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril ('Dnase, Rnase free')</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>PBS filtrado estéril</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta ('mini')</td><td>FST / Dumont</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência, 5.8 mL</td><td>fisherscientific</td><td>13-711-9AMMD</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A16046. AP</td><td>Uso a 0,5% para bloqueio e incubação de anticorpos</td></tr></tbody></table>

um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

An Ex Vivo Explant Model for Studying Glial Interactions in the Mouse Retina

Na escala macroscópica, as retinas explantadas permanecem essencialmente inalteradas em pontos de tempo de 1 e 3 dias, embora no último momento elas se tornem relativamente frágeis, necessitando de manuseio cuidadoso antes da fixação ou outros desfechos experimentais. As retinas devem ser relativamente planas, sem dobras (o que pode resultar em interrupção localizada na difusão de oxigênio e nutrientes) e devem ser suspensas no meio entre a interface ar-líquido e o inserto da cultura celular. No dia 3, uma faixa fraca po...

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

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Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs)...

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

Este artigo vídeo demonstra o estabelecimento de culturas de retina organotípicas wholemount e um procedimento para análise de cytospin exogenamente efeitos induzidos. Organotípicas retina culturas wholemount imitar...

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Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Este vídeo demonstra a cultura de células gliais de Müller (MG) isoladas de retinas de camundongos. As retinas são dissociadas em uma suspensão unicelular usando enzimas digestivas. As células são então cultivadas em um meio com um fator de crescimento que promove a proliferação de células MG e a mortalidade celular neuronal. As células neuronais mortas são removidas durante a passagem e as células MG são cultivadas para análise posterior.

Estabelecendo uma cultura de células gliais de Müller obtida de retinas de camundongos

Fonte: Bosco, A., et al.  In vivo Dinâmica da ativação microglial da retina durante a neurodegeneração: imagem oftalmoscópica confocal e morfometria celular no glaucoma de camundongo. J. Vis. Exp. (2015) Este vídeo demonstra imagens in vivo da microglia da retina em um modelo de glaucoma em camundongos. Um camundongo transgênico com microglia retiniana que expressa proteína fluorescente é posicionado sob um oftalmoscópio. A iluminação infravermelha é usada para localizar a cabeça do nervo...

Imagem in vivo da microglia retiniana em um modelo de camundongo com glaucoma

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Este artigo demonstra um método para visualizar e quantificar a motilidade e o contato da microglia com pontos pós-sinápticos na retina usando microscopia confocal de disco giratório.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

Aprenda a isolar retinas de camundongos para estudos ex vivo de neuroinflamação no glaucoma. Este protocolo preserva o ambiente natural das células gliais, permitindo investigações mais precisas sobre astrocitos e microglia.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

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