Name: Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a rotular células-tronco mesenquimais e embrionárias humanas com nanopartículas de óxido de ferro para rastreamento não invasivo por ressonância magnética. Este método permite avaliar terapias celulares in vivo.

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Este projeto foi suportado por uma concessão SEED Leon J. Thal do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia. Tobias Henning foi financiado por uma bolsa de Pesquisa do alemão Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Queremos agradecem Meneses Juanito para o seu conselho sobre a cultura de células estaminais embrionárias humanas.

Rotulagem de hMSC com Ferucarbotran Esta é a técnica para a rotulagem de células-tronco mesenquimais com Ferucarbotran, um óxido de ferro agente de contraste para ressonância magnética com base: <ol><li> Para começar, a chapa do células 18-24 horas antes do procedimento de rotulagem em frascos de T75 em uma confluência de 80%. Se você usar uma placa de cultura diferente, isso é equivalente a cerca de 10 mil células por cm 2. </li><li> No dia seguinte, começar a preparar os meios de comunicação de rotulagem, pela adição de 30 mL de Resovist a 8 ml de soro de mídia livre. Isto rótulo de um frasco T75, 80% confluência, correspondendo a uma concentração de 100 mg Fe / ml mídia. </li><li> Tire os meios de cultura e lavar as células uma vez com PBS ou soro livre de mídia. Isto é feito para se livrar de proteínas do soro residual e outros constituintes dos meios de comunicação que pudesse vincular o agente de contraste e eficiência rotulagem influência. </li><li> Adicionar a mídia de rotulagem para o frasco e colocar o balão de volta na incubadora. </li><li> Após 2 horas, adicionar 2 ml de FCS para que uma concentração final de FCS de 20% seja alcançado. Isto é feito para garantir que as células não recebem estímulo para diferenciar, mas sim crescer em seu ambiente familiar. </li><li> Incubar as células com mais de 18 horas. Este é o melhor feito durante a noite. </li><li> No dia seguinte, lavar as células com PBS, então trypsinize-los como de costume. </li><li> Uma vez tripsinizados, a suspensão de célula precisa ser lavado 3 vezes para se livrar de agente de contraste residual, livre na mídia. Isto é feito com PBS centrifugação as células a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> A final pellet celular pode ser colocado em suspensão e está pronto para novas experiências. </li><li> Contar as células agora, como alguns poderiam ter sido perdidas durante as etapas anteriores de lavagem. Além disso, realizar o teste de viabilidade neste momento utilizando o ensaio de exclusão Trypan blue e tomar algumas amostras para análise de espectrometria para medir a eficiência rotulagem. </li></ol> Rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com Ferumoxides <ol><li> Para começar a placa, o CTEh em pratos de 10cm, como de costume. Estes pratos são pré-revestidas com gelatina e têm células alimentadoras irradiada sobre eles. Você pode usar este protocolo para alimentação livre de culturas também. </li><li> Deixe o CTEh anexar e crescer para cerca de 3-4 dias, para que elas formam colônias de tamanho médio. Durante este tempo, garantir que as colônias não crescem a grande, como colônias maiores são mais difíceis de quebrar mais tarde. </li><li> Células diferenciadas podem contaminar essas culturas, por isso, dependendo da limpeza das colônias, você pode ter que se livrar de culturas diferenciadas por dissecção. </li><li> Prepare a mídia rotulagem que consiste em Ferumoxides a uma concentração de meios de comunicação CTEh 100μg/ml e cheio. Para isso, misture 89μl Ferumoxides e 10 ml de meio de crescimento integral. </li><li> Lavar o prato uma vez com a mídia completo. </li><li> Adicionar 10 ml de rotulagem de mídia por prato e incubar as células durante 4 horas. </li><li> Agora, a rotulagem é completa. Na próxima etapa, é necessário lavar as células e obter uma suspensão única célula para uso posterior. Para isso, primeiro lave o prato com PBS. </li><li> Então, substituir o PBS com 5 ml de tripsina 0,25% e incubar na incubadora por 5 minutos, ou até que as células detach. Ela ajuda a tocar o prato com freqüência. </li><li> As células já destacados. Tenha em mente que, se o prato continha grandes colônias pode haver alguns aglomerados esquerda. </li><li> Para se livrar desses aglomerados, pode-se misturar toda a suspensão uma vez, usando uma pipeta sorológica, em seguida, deixe descansar por mais 2 minutos. </li><li> Nós não usamos uma pipeta Eppendorf, sugando como repetidas das células através da ponta fina pode quebrar as membranas celulares. </li><li> Se clumps residual estão presentes, pode-se executar a suspensão de células através de um filtro de células 40μm. </li><li> Se tudo funcionou corretamente, uma suspensão única célula já existe que é misturado com um monte de detritos, provenientes do revestimento de gelatina, o CES-matriz e células mortas. Para se livrar disso, lave as células duas vezes girando-os para baixo a 400 rcf durante 5 minutos e ressuspender-los nos meios de comunicação completa. </li><li> Agora, o CES precisa ser isolado a partir de células de alimentação irradiados. Isto pode ser feito de forma eficiente por plaqueamento da suspensão de células em um prato de gelatina-revestido. </li><li> Se o prato não é manipulado, todas as células do sedimento vai para baixo, mas os alimentadores irá anexar mais rápido que o ESC. </li><li> Assim, se o sobrenadante é retirado após 45 minutos, ele deve conter principalmente ESC, enquanto os alimentadores devem ser, sobretudo, ligado ao prato. </li><li> Desta forma, uma única célula de suspensão magnética rotulados células estaminais embrionárias humanas que podem ser usados ​​para novas experiências é obtido. </li><li> Como no protocolo anterior, neste ponto, é preciso contar as células e colher amostras para avaliação da viabilidade e medição de eficiência rotulagem. </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

A representação não-invasivo de células-tronco é fundamental para o monitoramento praticamente qualquer terapia com células-tronco baseado. Uma melhor compreensão da na cinética in vivo de células-tronco rotulados, como visualizado nas imagens de RM, podem liderar o caminho para uma racional e uma utilização mais eficaz da haste terapias baseadas em células. Desde que nós usamos agentes de contraste clinicamente aplicáveis ​​e técnicas de imagem, os nossos protocolos apresentados devem ser facilmente traduzíveis para aplicações em pacientes...

<table><tbody><tr><td>D-MEM Glicose Alta</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>diluir gelatina em PBS até concentração final de 0,1 %</td></tr><tr><td>PBS (livre de Ca++ Mg++)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS caracterizado</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Celular (40 &amp;mu;m Nylon</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DMEM knockout</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de Soro para Células Knockout</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td>Reagente</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotran (Resovist)&amp;#174;)</td><td>Reagente</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem e hescs hmscs com óxido de ferro nanopartículas para não-invasiva em rastreamento vivo com ressonância magnética

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Nos últimos anos, investigação em células estaminais tem levado a uma melhor compreensão da biologia do desenvolvimento, várias doenças e seu impacto potencial na medicina regenerativa. Um método não-invasivo para monitorar as células-tronco transplantadas repetidamente in vivo, aumentaria consideravelmente a nossa capacidade de compreender os mecanismos que controlam a morte de células-tronco e identificar fatores tróficos e vias de sinalização que melhoram o enxerto de células-tronco. RM tem sido provado ser uma ferramenta eficaz para a representação em vivo das células-tronco com resolução anatômica perto microscópica. A fim de detectar células-tronco com MR, as células têm de ser rotulados com células agentes de contraste específicos MR. Para este fim, as nanopartículas de óxido de ferro, tais como partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIO), são aplicados, por causa de sua alta sensibilidade para a detecção de células e sua excelente biocompatibilidade. SPIO partículas são compostas de um núcleo de óxido de ferro e um casaco de dextran, carboxydextran ou amido, e função, criando inomogeneidades de campo local, que causam uma diminuição do sinal em imagens ponderadas em T2 MR. Esta apresentação vai demonstrar técnicas para a rotulagem de células-tronco com agentes de contraste clinicamente aplicáveis ​​MR para posterior não-invasiva no rastreamento vivo das células marcadas com ressonância magnética.

Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Nos últimos anos, a pesquisa com células-tronco levou a uma melhor compreensão da biologia do desenvolvimento, de diversas doenças e de seu impacto potencial na medicina regenerativa...

Bem-vindo ao laboratório da Dra. Haiku Dal Link. Gostaríamos de agradecer ao Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa pelo financiamento deste projeto para a avaliação de novas terapias com células-tronco. É importante rastrear de forma não invasiva as células injetadas in vivo.Isso é possível marcando as células in vitro com agentes de contraste específicos ou multifuncionais para imagem por ressonância magnética ou imagem óptica. Este vídeo mostrará como marcar células-tronco mesenquimais humanas e células-tronco embrionárias humanas para posterior imagem in vivo. Olá, sou Tobias Henning do Grupo de Pesquisa em Agentes de Contraste no Centro de Imagem Molecular e Funcional do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco.Hoje vou mostrar a você os procedimentos para marcação in vitro de células-tronco mesenquimais humanas com peric, carone e de células-tronco embrionárias humanas com óxidos de feme. Essa técnica é útil para localizar células injetadas in vivo ou para obter informações sobre seu estado funcional. Os procedimentos para marcação celular com agente consciente por RNM variam conforme o tipo de célula-tronco embrionária ou mesenquima

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Biology

Biologia

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês...

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Bioimaging métodos utilizados para avaliar biodistribuição das células de nanopartículas são aplicáveis ​​para monitorização terapêutica e de diagnóstico de compostos nanoformulated. Os métodos descritos neste documento são sensíveis e específicos, quando avaliada por coregistration histológica. As metodologias de fornecer um caminho de translação de roedores para aplicação em seres humanos.

BioImaging registradas de Nanomateriais para Monitoramento de Diagnóstico e Terapêutica

Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Rastreamento de células usando MRI ganhou notável atenção nos últimos anos. Este protocolo descreve a marcação das células dendríticas com flúor...

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Detalhes do protocolo estão previstas in vitro de células-tronco embrionárias humanas em matéria de rotulagem com a segunda geração de nanopartículas harmônicas. Também são apresentadas as metodologias de investigação hESC por microscopia multi-fotão e sua diferenciação em aglomerados cardíacas.

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A entrega celular direcionada é útil em uma variedade de aplicações biomédicas.  O objetivo deste protocolo é usar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPION) para rotular células e, assim, permitir abordagens de direcionamento de células magnéticas para um alto grau de controle sobre a entrega e localização celular.

Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.

Rastreamento de células-tronco mesenchymal rotuladas por óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após parto intranasal em um modelo de urina de urina de lesão cerebral traumática

Aprenda a rotular células-tronco mesenquimais e embrionárias humanas com nanopartículas de óxido de ferro para rastreamento não invasivo por ressonância magnética. Este método permite avaliar terapias celulares in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

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