Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Bem-vindo ao laboratório do Dr.Haiku Dal Link. Gostaríamos de agradecer ao Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia por financiar este projeto para a avaliação de novas terapias com células-tronco. É importante rastrear de forma não invasiva as células injetadas in vivo.

Isso é possível marcando as células in vitro com agentes de contraste específicos ou multifuncionais para imagens de RM ou imagens ópticas. Este vídeo mostrará como rotular células-tronco mesenquimais humanas e embrionárias humanas para imagens in vivo subsequentes. Olá, sou Tobias Henning, do Grupo de Pesquisa de Agentes de Contraste do Centro de Imagens Moleculares e Funcionais do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco.

Hoje vou mostrar procedimentos para marcação in vitro de células-tronco mesenquimais humanas com peric, carona e de células-tronco embrionárias humanas com óxidos de phem. Esta técnica é útil para localizar células injetadas in vivo ou para obter informações sobre seu estado funcional. Os procedimentos para marcação celular com agente consciente de ressonância magnética variam para células-tronco embrionárias e mesenquimais, mas ambas as técnicas envolvem as seguintes etapas, preparando a cultura de células que está plaqueando as células como aderir às culturas de células preparação de marcação, marcação de meio de células por simples incubação tripsina de células-tronco e lavagem de agente consciente livre avaliação da eficiência de marcação e viabilidade celular.

Então, vamos começar e rotular algumas células. Agora vamos começar marcando células-tronco mesenquimais com Theo Carbatrol. Primeiro, mostrarei a técnica para rotular células-tronco mesenquimais humanas com theo carron e agente de contraste à base de óxido de ferro para imagens de ressonância magnética.

Para começar, plaqueamos as células 18 a 24 horas antes do procedimento de rotulagem em frascos T 75 a uma confluência de 80%Caso contrário, se você usar uma placa de cultura diferente que equivale a cerca de 10.000 células por centímetro quadrado no dia seguinte, começamos com a preparação do meio de rotulagem adicionando 30 microlitros de reservista a oito mililitros de meio livre de soro. Isso rotulará um T 75 FLA com uma cofluência de 80% e corresponde a uma concentração de cem microgramas de ferro por mililitro de meio. Agora retiramos o meio de cultura e lavamos as células uma vez com PBS ou meio livre de soro.

Fazemos isso para nos livrarmos de proteínas séricas residuais e outros constituintes do meio que podem se ligar aos agentes de contraste e influenciar a eficiência da marcação. Adicione o meio de rotulagem ao frasco e coloque o frasco de volta na incubadora. Após duas horas, adicionar dois ml de FCS para obter uma concentração final de 20% de FCS.

Fazemos isso para garantir que as células não recebam nenhum estímulo para diferenciar que estão mortas em seu ambiente familiar. Agora incubamos as células por 18 horas. No dia seguinte, enxaguamos as células com PBS e, em seguida, as enxugamos de acordo com os protocolos de cultura padrão para nos livrarmos do agente de contraste livre.

Uma vez inizado o Tryps, a suspensão celular é lavada três vezes centrifugando a 400 RCF por cinco minutos e suspendendo novamente em PBS. É isso. A célula final P pode ser ressuspensa e está pronta para novos experimentos.

Contamos as células agora, pois podemos ter perdido algumas durante as etapas de lavagem anteriores. Também realizamos testes de viabilidade neste momento usando o ensaio de exclusão trippin blue e coletamos algumas amostras para análise espectrométrica para medir a eficiência da marcação. Agora, deixe-me mostrar como rotular células-tronco embrionárias humanas com óxidos de fem.

Para começar, colocamos as células-tronco embrionárias humanas em placas de 10 centímetros. Como de costume, esses pratos são pré-codificados com gelatina e têm células alimentadoras irradiadas neles. Você também pode usar este protocolo para culturas livres de alimentador.

Deixamos as células-tronco embrionárias humanas se ligarem e crescerem por aproximadamente três a quatro dias para que formem colônias de tamanho médio. Durante esse período, garantimos que as colônias não cresçam muito porque as colônias maiores são mais difíceis de quebrar. Posteriormente, células diferenciadas podem contaminar essas culturas.

Portanto, dependendo da limpeza das colônias, podemos ter que nos livrar de culturas diferenciadas por dissecação. Agora preparamos o meio de rotulagem que consiste em óxidos de teorema a uma concentração de cem microgramas de ferro por mililitro e meio completo de células-tronco embrionárias humanas. Para isso, misturamos 89 microlitros, óxidos de phem e 10 mililitros de meios de crescimento completos.

Quanto às células-tronco mesenquimais, lavamos o prato uma vez com meio completo para nos livrarmos de células mortas ou detritos. Em seguida, adicionamos 10 mililitros de mídia de rotulagem por prato e incubamos as células por quatro horas. Agora a rotulagem está completa.

Na próxima etapa, precisamos lavar as células e obter uma suspensão de célula única. Para uso posterior Para isso, primeiro enxaguamos o prato com PBS. Agora substituímos o PBS por cinco mililitros de 0,25% de tripsina e incubamos por cinco minutos na incubadora ou até que as células se desprendam.

Ajuda bater no prato com frequência que as células já se soltaram. Lembre-se de que, se o prato contiver colônias maiores, podem ser alguns aglomerados deixados para se livrar desses aglomerados. Misturamos toda a suspensão pipetando para cima e para baixo, usando uma pipeta sorológica, e depois deixamos descansar por mais dois minutos.

Na tripsina. Não usamos uma pipeta eppendorf, pois a pipetagem repetida das células através da ponta fina pode quebrar as membranas celulares se tudo funcionar bem. Temos uma única suspensão celular agora que é misturada com muitos detritos originários da gelatina que reveste a matriz de células-tronco embrionárias e células mortas.

Agora podemos nos livrar dos aglomerados ou complexos remanescentes passando as células por um filtro de células de 40 micrômetros. Agora precisamos isolar as células-tronco embrionárias humanas das células alimentadoras irradiadas. Isso pode ser feito de forma eficiente colocando a suspensão celular em um prato revestido de gelatina.

Se não manipularmos o prato, todas as células se sedimentarão, mas os alimentadores se ligarão mais rápido do que as células-tronco embrionárias humanas. Portanto, se retirarmos o SUP natin após 45 minutos, ele deve conter principalmente células-tronco embrionárias humanas, enquanto os comedouros devem ser fixados principalmente no prato. Dessa forma, obtemos uma suspensão de célula única de células-tronco embrionárias humanas marcadas magneticamente que podem ser usadas para experimentos posteriores como no protocolo anterior.

Neste ponto, você precisa contar as células e coletar amostras para avaliação de viabilidade e medição da eficiência da marcação. Então, isso termina os protocolos que eu queria mostrar a vocês hoje. Agora vamos dar uma olhada em como podemos rastrear células-tronco marcadas in vivo.

Este slide mostra as células-tronco marcadas com OC Carone. Depois de terem sido injetados no cérebro de um camundongo, suspendemos novamente 20.000 células no volume de 75 nanolitros e as injetamos na zona subventricular. O óxido de ferro nas células implantadas causa um artefato de suscetibilidade que pode ser visto na RM. Imagens.

Acabamos de mostrar como rotular células-tronco embrionárias e mesenquimais. In vitro com agentes Mr.Contrast rastreando células-tronco mesenquimais e embrionárias in vivo tem um enorme potencial para avaliar novas terapias com células-tronco. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com a rotulagem do seu celular.