Quantificação de violaceína em Chromobacterium violaceum e sua inibição por compostos bioativos

Nossa pesquisa visa identificar compostos que inibem a detecção de quorum, que regula os fenótipos chave. Este protocolo rastreia moléculas que reduzem a produção de violaceína sem afetar o crescimento bacteriano, sugerindo interferência de detecção de quorum. Estudos recentes identificaram novos compostos bioativos que inibem a detecção de quórum sem afetar o crescimento bacteriano, reforçando seu potencial como agentes antivirulência contra bactérias resistentes a antibióticos.

Os principais desafios incluem a especificidade da inibição do quorum sensing, uma vez que os compostos podem afetar o crescimento ou as características. Neste protocolo, denominado deferência e solubilidade, quantificação de balanceamento de impacto, requer um manuseio cuidadoso. Estabelecemos um protocolo utilizado em compostos bioativos em concentrações sub-inibitórias que não afetam o crescimento bacteriano.

Esta é uma premissa fundamental para iniciar a sinalização de detecção de quorum diferente da pesquisa antimicrobiana. Vamos nos concentrar na identificação de novos inibidores do estado de quorum e elucidar os mecanismos de inibição da comunicação, especialmente em bactérias relevantes para a alimentação e a saúde. Para começar, cultive uma cultura de cinco mililitros de cromobactéria violaceum ATCC 12472 em Luria Bertani ou caldo LB.

Incube a cultura a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada a 220 rotações por minuto por 24 horas. Meça a densidade óptica da cultura noturna e ajuste-a para aproximadamente uma vez 10 elevado a oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Usando o caldo LB.

Para a preparação do composto, pese o composto bioativo e dilua-o em DMSO puro ou em uma mistura de DMSO e água, dependendo da solubilidade. Pegue um prato de fundo plano de 96 poços e adicione caldo LB junto com o composto bioativo de acordo com um esquema de diluição em série. Para calcular o volume necessário de solução de estoque para a concentração desejada em cada poço, aplique a fórmula.

Na primeira coluna de cada soro de diluição de cereais. Adicione 196 microlitros de caldo Luria Bertani às colunas três, cinco e sete. Em seguida, nas colunas subsequentes usadas para a diluição, adicione 100 microlitros de caldo Luria Bertani às colunas quatro, seis e oito.

Para iniciar a diluição seriada, adicione quatro microlitros do composto bioativo ao primeiro poço de cada conjunto, que corresponde às colunas três, cinco e sete. Após a mistura, transfira 100 microlitros de cada poço para a coluna adjacente. Continuar a diluição em série atingindo as colunas quatro, seis e oito.

Repita todo o procedimento em triplicado para cada concentração de cada composto usando pontas frescas para evitar contaminação cruzada. Adicione 80 microlitros de caldo Luria Bertani às fileiras B a D em todos os poços. Elevando o total para 180 microlitros por poço.

Em seguida, adicionar 20 microlitros da cultura padronizada de cromobactéria violaceum do preparo anterior a cada um desses poços, atingindo um volume final de 200 microlitros. Com base na compatibilidade do espectrofotômetro. Cubra a microplaca com uma tampa ou filme de vedação para evitar a evaporação.

Incubar a placa selada a 30 graus Celsius com agitação a 130 rotações por minuto durante 24 horas. Após a incubação, transfira a placa para uma incubadora de secagem ajustada a 60 graus Celsius. Retire a tampa e deixe secar completamente por aproximadamente oito horas.

Depois de seco, remova a placa da incubadora e adicione 200 microlitros de DMSO puro a cada poço. Cubra a placa e incube-a a 25 graus Celsius com agitação a 130 rotações por minuto por 30 minutos para dissolver o pigmento violaceína. Após a incubação, transfira cuidadosamente 100 microlitros da solução de violaceína dissolvida para uma nova microplaca.

Evitar o contato entre a ponta da pipeta e as paredes do poço. Meça a absorbância da violaceína a 595 nanômetros em um espectrofotômetro de microplacas com a tampa para evitar contaminação. Agite por cinco segundos antes de cada leitura e faça a leitura com a tampa fechada para evitar contaminação.

Para calcular a produção de violaceína, primeiro subtraia a absorbância do branco de cada amostra para excluir a interferência de fundo e, em seguida, calcule a porcentagem de violaceína usando o controle não tratado como referência com a equação. Três compostos bioativos, resveratrol, farnesol e linalol, foram testados quanto à sua capacidade de inibir a produção de violaceína em cromobactéria violaceum ATCC 12472. O farnesol reduziu significativamente a produção de violaceína para 9% a 200 microgramas por mililitro e para 19% a 100 microgramas por mililitro, em comparação com 100% no controle não tratado.

O tratamento com linalol em 200 e 100 microgramas por mililitro resultou na produção de violaceína de 32%, mostrando uma inibição de 68% em relação ao controle. O resveratrol a 25 microgramas por mililitro reduziu a produção de violaceína para 15%enquanto a 12 microgramas por mililitro, atingiu 30%em comparação com 100%no controle não tratado. As imagens de microplacas confirmaram visualmente a redução da pigmentação da violaceína para todos os tratamentos em comparação com o controle não tratado.