Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

O objetivo de nossa pesquisa é desenvolver um método altamente econômico e ético favorável para a triagem de compostos neurotóxicos. Os métodos tradicionais de testes toxicológicos geralmente dependem de modelos de taxa virtual, que são caros, demorados e, de outra forma, preocupações éticas, como sabemos. Queríamos explorar se poderíamos detectar sinais precoces de neurotoxicidade usando um modelo alternativo como um Drosophila melanogaster que é sensível e escalável. Este protocolo nos ajuda a detectar fenótipos de comportamento, como alterações de padrões de movimento e hiperatividade, mas também declínio motor progressivo ou interrupções escritas de segurança, e a ampla preferência também é testada.

O que torna nosso protocolo vantajoso é que ele combina o ensaio de escalada clássico com uma tecnologia de monitoramento em tempo real, e isso nos permite capturar deficiências motoras sutis que podem passar despercebidas. Por métodos tradicionais, fornecendo maior sensibilidade e dados comportamentais mais precisos.

[Narrador] Para começar, transfira suavemente as moscas para uma garrafa vazia. Coloque a garrafa contendo as moscas dentro de uma caixa cheia de gelo, garantindo que toda a garrafa esteja coberta. Após um minuto, bata suavemente no frasco para verificar se todas as moscas estão anestesiadas. Prepare um recipiente menor cheio de gelo. Coloque uma placa de Petri ou uma superfície plana e limpa em cima do gelo para criar uma plataforma gelada. Agora inverta o tubo sobre a placa de Petri resfriada e bata suavemente para liberar as moscas na superfície fria. Transfira cuidadosamente as moscas para frascos vazios. Permita que as moscas se recuperem da anestesia por 30 minutos em um ambiente controlado a 25 graus Celsius com um ciclo de luz escura de 12 horas e 50% de umidade. Em seguida, para a preparação da alimentação microcapilar, use uma pipeta para carregar manualmente 10 microlitros da solução de teste em cada tubo microcapilar, garantindo um volume consistente em todas as amostras. Adicione de três a cinco microlitros de óleo mineral à extremidade aberta de cada tubo microcapilar para evitar evaporação e vazamento durante o experimento. Insira os microcapilares pré-preenchidos através de orifícios nos tampões do frasco de algodão, garantindo um ajuste seguro. Coloque os frascos contendo moscas em uma incubadora ajustada para 25 graus Celsius com um ciclo claro escuro de 12 horas e deixe os frascos na incubadora durante o experimento. A cada 12 horas, transfira as moscas para um frasco limpo e vazio para avaliar sua atividade locomotora. Meça e marque a linha a sete centímetros do fundo do frasco usando um marcador permanente. Esta marca servirá como alvo de escalada. Posicione uma câmera ou telefone em um local estável para registrar o comportamento de escalada. Garanta iluminação adequada e um fundo transparente para permitir visibilidade e análise claras. Confirme se a configuração experimental é compatível com o campo de visão da câmera e comece a gravar. Revise as gravações de vídeo e meça o tempo que cada mosca levou para atingir a marca de sete centímetros. Prepare os microcapilares de alimentação com a amostra e o selo de óleo mineral, conforme mostrado anteriormente. Em seguida, prepare câmaras de locomoção individuais usando canudos de plástico transparente cortados em aproximadamente seis centímetros de comprimento. Sele uma extremidade de cada canudo com um filme transparente para criar um fechamento hermético. Perto da extremidade selada do canudo, crie um pequeno orifício para inserir o microcapilar de alimentação, garantindo que ele se encaixe perfeitamente e não vaze ou se mova durante o ensaio. Depois de anestesiar e segregar as moscas como mostrado anteriormente, coloque delicadamente uma mosca anestesiada em cada tubo usando um pincel fino. Sele a extremidade aberta de cada tubo com filme transparente ou um tampão de algodão, permitindo o fluxo de ar e evitando a fuga. Agora insira um microcapilar pré-preenchido em cada câmara preparada através do orifício designado. Coloque os tubos montados na arena de ensaio, certificando-se de que os microcapilares permaneçam acessíveis para substituição diária. Coloque toda a configuração dentro de uma câmara mantida a 25 graus Celsius com um ciclo de luz escura de 12 horas e 50% de umidade. Conecte o dispositivo ao sistema de rastreamento local ou à rede. Acesse a plataforma de software e localize o dispositivo atribuído ao experimento. Certifique-se de que o sistema esteja rastreando corretamente cada mosca com base em marcadores visuais. Insira todos os metadados experimentais e comece a gravar o ensaio. A capacidade de escalada avaliada usando o ensaio de geotaxia negativa em 24 e 48 horas mostra desempenho semelhante entre os grupos controle e tratamento em 24 horas, indicando que não há déficits motores imediatos. Em 48 horas, as moscas tratadas levam quase o dobro do tempo para subir em comparação com os controles que refletem comprometimento motor significativo. O rastreamento contínuo da atividade revela que as moscas tratadas inicialmente exibem movimento intensificado, mas sua atividade diminui drasticamente após 12 horas, sugerindo hiperexcitabilidade precoce seguida de redução da função motora. Por 24 a 40 horas, as moscas tratadas mostram movimento reduzido em comparação com os controles. No geral, as moscas tratadas têm aproximadamente 20% de atividade reduzida em 40 horas. As moscas tratadas responderam inicialmente com um atraso aos sinais de luz seguidos por alinhamento circadiano transitório, mas perderam progressivamente a ritmicidade em 48 horas, provavelmente como resultado do déficit da locomotiva. As moscas tratadas preferem zonas de luz mais do que controles.