Name: In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a reconstituir redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes separadas por fase. Este método permite encapsular proteínas como FtsZ e actina para estudar dinâmicas celulares sintéticas.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (DOPG)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>840475</td><td>Em clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>850375</td><td>Em clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal de sódio) (18:1 Biotinyl Cap PE)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>870273</td><td>In clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (DPPG)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>840455</td><td>Em clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>850355</td><td>Em clorofórmio</td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin (músculo esquelético alfa-actina, coelho)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Actin (músculo esquelético alfa-actina, coelho)</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td>Banho</td></tr><tr><td>de Pó Sonicator</td><td>Branson&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Bransonic Limpador Ultrassônico</td></tr><tr><td>Biotina-Actina (músculo esquelético alfa-actina, coelho)</td> <td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (ovino)</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>700000</td><td>Em clorofórmio</td></tr><tr><td>Decano</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascin (humano, recombinante)</td><td>Citoesqueleto Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (OptiPrep)</td>Laser confocal <td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 microscópio de varredura</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; &vezes; &thinsp;/1,2 objetiva de imersão em água. Lasers de estado sólido bombeados por diodo: 488&thinsp; nm e 640&thinsp; Nm.</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Miosina II (músculo esquelético de coelho)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidina</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Fiske Micro-Osmômetro modelo 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td>&nbsp; GmbH</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstituição de redes citoesqueléticas no interior de vesículas unilamelares gigantes separadas por fase (guvs)

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

Como primeiro passo, GUVs com separação de fase por membrana foram produzidos seguindo uma abordagem de emulsão invertida modificada (Figura 1A). Isso resulta em um alto rendimento de GUVs, que exibem uma membrana desmisturada em domínios Ld e Lo , conforme representado pelo rótulo Atto 655-DOPE no domínio Ld e regiões escuras correspondentes a domínios Lo não marcados (Figura 1B). Este método produz GUVs separados por fase de tamanhos que variam de 5 a 30 μm (Figura 1C) em temperaturas elevadas (todas as etapas realizadas a 37 ° C e fotografadas em RT). Além disso, as velocidades de centrifugação foram ajustadas para garantir a incorporação dos lipídios componentes originais nos GUVs, bem como para evitar a superpopulação excessiva.
Além disso, para demonstrar o encapsulamento bem-sucedido de biomoléculas usando o método de emulsão descrito no protocolo atual, as redes FtsZ e actina foram reconstituídas em experimentos individuais. As redes FtsZ são recapituladas dentro de GUVs, que emergem como filamentos que se ligam preferencialmente a domínios Ld por meio de sua sequência de direcionamento de membrana (MTS) na presença de 2,5 mM GTP e 50 g / L Ficoll70 (conforme ilustrado na Figura 2). As redes foram observadas aproximadamente 1 h após a etapa de encapsulamento. No entanto, as redes de actomiosina emergem como feixes finos (em contraste com as redes espessas de FtsZ) após a reconstituição dentro de GUVs (Figura 3). Deve-se notar que os lipídios biotinilados desempenham um papel crucial na ligação das redes de actomiosina à membrana dos GUVs. Sem lipídios biotinilados, os feixes de actomiosina não podem adotar uma configuração curva e permanecer como feixes retos, curtos e rígidos no lúmen, em vez de aderir à membrana como uma malha emaranhada de feixes longos (Figura 4).
No protocolo de emulsão modificado, a velocidade de centrifugação é ajustada para obter GUVs separados por fase, conforme mencionado anteriormente. De fato, velocidades de centrifugação mais altas com amostras contendo redes de actomiosina (600 x g por 15 min) resultam na agregação de vesículas em uma configuração semelhante a um tecido dentro do poço de produção. Assim, em todos os experimentos de reconstituição padrão de redes de actomiosina, a velocidade ideal de centrifugação foi definida em 200 x g para obter GUVs não agregados (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
Figura 1: Geração de GUVs separados por fase em um pote empregando o método de transferência de emulsão dupla. (A) Esquema experimental das principais etapas na produção de vesículas separadas por fase por meio de transferência de emulsão dupla. (B) Imagem de projeção Z confocal dos GUVs resultantes gerados seguindo o método descrito em A. A barra da escala é de 50 μm. (C) Gráfico de barras com a fração de GUVs separados por fase gerados de acordo com seu diâmetro. Experimentos realizados n = 3, o número total de GUVs analisados por experimento = 100. Os dados mostrados como valores médios, os pontos de dados individuais são os três experimentos independentes. As barras de erro representam o desvio padrão dos três experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
Figura 2: Vesículas separadas por fase com redes FtsZ encapsuladas. (A) Imagens de projeção 3D confocais realizadas em uma pilha z totalmente adquirida de um GUV separado por fase contendo uma rede FtsZ. (B) Imagens confocais de projeção Z realizadas apenas na metade superior da vesícula. Devido à formação heterogênea de domínios sobre a superfície do GUV, a reconstrução 3D dos cortes confocais adquiridos mostra a sobreposição de domínios lipídicos das áreas superior e inferior da vesícula. Para evitar sobreposições e facilitar a inspeção visual dos domínios, a metade inferior das pilhas z adquiridas é removida do arquivo. A metade superior resultante é então usada para sua projeção 3D por meio de desvio padrão. As barras de escala são ambas de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
Figura 3: Vesículas separadas por fase com redes de actomiosina encapsuladas. (A) Imagens confocais de projeção Z de uma pilha inteira adquirida com uma visão de zoom do poço após a produção da vesícula. O alto rendimento de vesículas obtido permite o estudo de diferentes estruturas de actomiosina dentro das vesículas. A barra de escala é de 50 μm. (B) Imagens confocais de projeção Z realizadas na metade superior de uma vesícula. Para facilitar a análise visual dos domínios lipídicos, apenas a metade superior das fatias da imagem é usada para realizar uma projeção 3D. A barra de escala é de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
Figura 4: Importância dos lipídios biotinilados para a geração de redes de actomiosina ligadas à membrana dentro de vesículas separadas por fase. Projeções 3D confocais representando vesículas separadas por fase com redes de actomiosina não anexadas. Se os lipídios biotinilados não forem incorporados à mistura, as estruturas de actomiosina se formam no lúmen e não adquirem uma configuração curva no folheto interno das vesículas (painel direito, actina marcada com Atto488). A barra de escala é de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
Figura 5: Efeito da velocidade de centrifugação na produção de vesículas separadas por fase por meio de transferência de emulsão. Imagens 2D confocais mostrando uma amostra GUV gerada empregando uma força de centrifugação de 600 x g por 15 min. A velocidade de centrifugação empregada, superior aos 200 x g otimizados, resulta na agregação de vesículas em uma configuração semelhante a um tecido dentro do poço. A barra de escala é de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

in-vitro-reconstitution-cytoskeletal-networks-inside-phase-separated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

Experimentos na fase separado unilamellar gigante vesículas (GUVs) frequentemente negligenciam condições de solução fisiológica. Este trabalho apresenta abordagens para estudar o efeito de buffer de alta salinidade na separação de fases líquido-líquido em GUVs multicomponentes carregadas como uma função de trans-membrana solução assimetria e temperatura.

Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

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Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.

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Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

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Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

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Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

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In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

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