In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

Nossa pesquisa explora se uma célula sintética mínima pode replicar funções biológicas importantes, concentrando-se no design de membranas que imitam de perto a estrutura e o comportamento das membranas celulares naturais.

Diferentes tecnologias são empregadas para fazer vesículas separadas por fase e usar esses microtransportadores para uma variedade de aplicações. As tecnologias, por exemplo, são cDICE de camada dupla e eletroformação. Um grande desafio é manter a funcionalidade da proteína enquanto gera separação de fases na vesícula da membrana. O aumento da temperatura pode desestabilizar as proteínas e outras biomoléculas.

[Narrador] Para começar, obtenha frascos de misturas lipídicas biotiniladas e não biotiniladas. Dissolva 50 microlitros de cada mistura lipídica de 32 milimolares em clorofórmio. Em seguida, seque-os em dois frascos de vidro sob fluxo de gás nitrogênio por aproximadamente 15 minutos. Coloque os frascos de vidro em um dessecador. Armazene-os sob vácuo por aproximadamente 30 minutos para remover qualquer clorofórmio residual. Agora, disperse os filmes lipídicos secos em uma mistura de 20 microlitros de decano e 500 microlitros de óleo mineral nos mesmos frascos para atingir uma concentração lipídica final de 3,2 milimolar. Usando um sonicador de banho, sonice as duas misturas a aproximadamente 50 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, transfira as misturas de lipídios e óleos para dois tubos. Enquanto as misturas estão incubando, prepare a mistura de encapsulamento interno para proteínas. Para preparar a mistura de proteínas FtsZ, adicione os reagentes listados a um volume final de 10 microlitros em um tubo. Mantenha a mistura no gelo até o uso. Para o encapsulamento de feixes de actina, primeiro prepare 10 microlitros do Master Mix de actina, contendo 86% de G-actina, 10% de ATTO 488 actina e 4% de actina biotinilada em água. Mantenha a mistura no gelo e proteja-a da luz. Pouco antes de usar, prepare a solução final de actina adicionando, em ordem, iodixanol, água, NeutrAvidina, BSA, Ficoll 70, tampão de polimerização de actina 10x, A-Mix, fascina e ATP. Misture bem e use cinco microlitros para encapsulamento. Para encapsular o FtsZ, pipete 500 microlitros de tampão de reação FtsZ em um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Adicione suavemente 200 microlitros de mistura de lipídios e óleo para formar uma interface óleo-água. Em um segundo tubo, adicione 200 microlitros de mistura de lipídios e óleo. Incube este tubo a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, pipete cinco microlitros da mistura de proteínas FtsZ para o tubo de lipídios e óleo incubado, permitindo que ele afunde como uma gota. Bata suavemente no tubo cinco a seis vezes, até que a solução fique turva, para formar uma emulsão. Pipetar cuidadosamente esta emulsão sobre a interface óleo-água preparada anteriormente. Em seguida, centrifugue a amostra a 6.000 g por 30 minutos a 37 graus Celsius. Resfrie a amostra à temperatura ambiente por 30 minutos. Agora, use uma pipeta para remover suavemente a camada superior de óleo, deixando 100 a 200 microlitros de solução para imagem. Corte a ponta de uma pipeta em ângulo. Use-o para recuperar 50 a 100 microlitros de solução GUV do fundo do tubo. Para encapsular a actina diretamente em uma placa de 96 poços, combine 198 microlitros de glicose de dois molares com 802 microlitros de água para preparar uma solução externa de glicose correspondente à osmolaridade da mistura interna de actina. Passivar um poço de uma placa de 96 poços adicionando 100 microlitros de BSA de 10 gramas por litro a um poço. Após uma incubação de 10 a 15 minutos, lave o poço cinco vezes com 100 microlitros de solução externa. Deixe 100 microlitros da lavagem final. Agora, adicione suavemente 50 microlitros de mistura de lipídios e óleo ao poço, apoiando a pipeta na parede lateral para garantir a estratificação correta em cima da solução externa. Em um tubo separado, adicione 100 microlitros de lipídios em óleo e incube. Adicione 2,5 microlitros de solução final de actina ao tubo de lipídio e óleo incubado, permitindo que ele afunde como uma gota. Bata suavemente no fundo do tubo 10 a 20 vezes, até que a mistura fique turva. Pipete suavemente a emulsão no centro da monocamada de óleo no poço, sem quebrar a interface. Em seguida, centrifugue a placa de 96 poços a 200 g por 20 minutos a 37 graus Celsius. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente por 30 minutos antes de fazer a imagem. Foram obtidas vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs, com membranas desmisturadas em domínios desordenados e ordenados líquidos, e um alto rendimento de vesículas com tamanho entre cinco e 30 micrômetros. As redes FtsZ foram recapituladas dentro dos GUVs e preferencialmente localizadas nos domínios de membrana desordenada líquida na presença de GTP e Ficoll 70. As redes de actina, quando reconstituídas, apareceram como feixes finos aderindo à membrana e formando estruturas esparsas semelhantes a teias. Sem lipídios biotinilados, os feixes de actina não aderiram à membrana e, em vez disso, permaneceram rígidos e retos dentro do lúmen da vesícula. Sob condições de centrifugação mais altas, as vesículas contendo actina miosina agregaram-se em uma arquitetura semelhante a um tecido compactado no poço de produção.