Name: Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a medir o metabolismo de piruvato em células vivas usando RMN de ¹³C hiperpolarizada. Este protocolo não destrutivo permite rastreamento em tempo real para estudos metabólicos e triagem de fármacos.

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<table><tbody><tr><td>[1-13C] ácido pirúvico</td><td>Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>Impressora 3D</td><td>Elegoo</td><td>Saturno 2</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Circulação Externa para Bomba</td><td>COMO UM</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de conexões sem flange</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro com núcleo</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>Diâmetro interno ~0,9 mm, comprimento 90 mm</td></tr><tr><td>Bomba de circulação magnética</td><td>COMO UM</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Pesquisa Mestrelab</td><td></td><td>Software de processamento e análise espectral de RMN</td></tr><tr><td>Minha seringa de injeção</td><td>Corporação Nipro</td><td>8277</td><td>0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 peças</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; Oxford Instruments Co. Ltd.&nbsp; e Polarize IVS Co. Ltd.&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tubo PEEK</td><td>COMO UM</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Mini Bomba Peristáltica Bio</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Tipo de alta precisão e ampla vazão para fluxo médio estável</td></tr><tr><td>Resina</td><td>Siraya Tecnologia</td><td>Preto Esfumaçado</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Septo do frasco de silicone/PTFE</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de sódio 80-120</td><td>Corporação Química Pura FUJIFILM Wako</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>Software SPINit</td><td>RS2D</td><td></td><td>Software de RMN no polarizador DNP</td></tr><tr><td>Esponja</td><td>-</td><td>-</td><td>Esponja comercialmente disponível cortada no tamanho para estabilização do gel</td></tr><tr><td>Torneira de três vias</td><td>COMO UM</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software de aquisição e processamento de dados de RMN</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>Resina curável por UV</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>COMO UM</td><td>1-5832-41</td><td>Robô Térmico Série TR TR-1&alpha; para manter 37 &deg; Temperatura C</td></tr><tr><td>Tubo de RMN com tampa de rosca Wilmad</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Frequência 400 MHz, diâmetro 10 mm, L 178 mm.</td></tr></tbody></table>

detecção metabólica em tempo real em células vivas usando rmn hiperpolarizada de 13c

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

Neste estudo, um sistema fabricado foi acoplado à espectroscopia de RMN hiperpolarizada de 13C para medir o metabolismo do piruvato em células vivas em tempo real. Os principais sinais detectados no espectro de RMN de 1D 13C corresponderam ao piruvato (aproximadamente 171 ppm) e lactato (aproximadamente 183 ppm)21, permitindo avaliar a conversão metabólica do piruvato em lactato em condições fisiológicas (Figura 4).
Qualidade espectral e dinâmica de sinal Resultados representativos de medições repetidas na mesma amostra usando células SCCVII - uma linha de carcinoma de células escamosas de camundongo frequentemente usada em estudos de ressonância magnética hiperpolarizada - são mostrados na Figura 5. A primeira medição exibiu um claro aumento no sinal de lactato, indicando conversão metabólica ativa. No entanto, medições subsequentes feitas em intervalos de 1,5 h mostraram um declínio progressivo na atividade metabólica. Essa redução dependente do tempo provavelmente reflete o estresse biológico ou a adaptação induzida pela injeção inicial de piruvato. Notavelmente, uma modulação metabólica transitória semelhante foi relatada in vivo usando ressonância magnética hiperpolarizada e EPRI, onde a oxigenação do tumor diminuiu temporariamente após a administração de piruvato22. Esses resultados demonstram que a repetibilidade dessas medições permite o rastreamento não destrutivo de mudanças metabólicas dinâmicas - uma vantagem difícil de alcançar com métodos destrutivos23.
Para avaliar a aplicabilidade deste protocolo a outros tipos de células, medições adicionais foram realizadas usando células HeLa, uma linha de células cancerígenas humanas amplamente utilizadas. Conforme mostrado na Figura 6, as células HeLa também exibiram clara conversão de piruvato em lactato. Embora a intensidade do sinal tenha diminuído gradualmente devido ao relaxamento de T1, a relação sinal-ruído permaneceu suficiente durante todo o período de aquisição de 60 s. Essas descobertas sugerem que o protocolo atual é amplamente aplicável e pode servir como uma ferramenta versátil para perfis metabólicos em tempo real em vários tipos de células.
Embora o decaimento rápido do sinal seja uma limitação inerente da RMN baseada em DNP, nosso sistema de mistura in situ minimiza o atraso entre a dissolução e a medição, aumentando assim a sensibilidade de detecção. Refinamentos adicionais, como a otimização da composição da matriz de gel, podem expandir a aplicabilidade desse método a uma gama mais ampla de sistemas biológicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho geral da cultura de células à medição de RMN hiperpolarizada. O processo começa com a cultura de células (~2 semanas), seguida pela preparação do gel de alginato (~60 min) para encapsular as células para uma medição estável. Em seguida, a hiperpolarização é realizada usando um sistema polarizador DNP (~ 60 min) e a medição de RMN é realizada usando um espectrômetro de RMN de 400 MHz (~ 5 min). As fotografias à direita mostram os instrumentos correspondentes usados neste fluxo de trabalho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Figura 2: Configuração do biorreator para medição de RMN hiperpolarizada. (A) Diagrama esquemático da configuração do biorreator. O meio de cultura é introduzido no tubo de RMN através da entrada A e posteriormente direcionado para o lixo. Grânulos de alginato contendo células vivas são colocados dentro do tubo de RMN. Durante as medições de RMN hiperpolarizada, a sonda hiperpolarizada é injetada através da entrada B, rotulada como entrada da sonda hiperpolarizada. (B) Fotografia de toda a configuração do biorreator, com a tubulação de entrada e saída claramente identificada. (C) Vista aproximada do interruptor da tubulação de entrada, mostrando a entrada A (perfusão média) e a entrada B (injeção de sonda hiperpolarizada). (D) Projeto CAD e (E) fotografia representativa do componente de fixação de esponja impresso em 3D colocado dentro do tubo de RMN. O componente inclui um orifício para guiar um capilar de vidro que fornece a solução de substrato hiperpolarizado e uma plataforma para segurar uma esponja. O componente em si não se encaixa firmemente na parede interna do tubo de RMN; (F) em vez disso, uma esponja é inserida ao redor dele para preencher a lacuna. Essa estrutura estabiliza o componente e permite que o meio residual flua para cima através da esponja, eliminando a necessidade de um orifício de saída adicional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Figura 3: Preparação do gel de alginato. (A) Ilustração esquemática e (B) fotografia do aparelho de formação de bola de gel de alginato. A imagem à esquerda mostra toda a configuração, incluindo o tubo da centrífuga com uma seringa fixada em sua tampa modificada. A imagem superior direita mostra uma tampa com um pequeno orifício para a ponta da seringa, enquanto a imagem inferior direita mostra uma tampa com uma abertura quadrada para posicionamento estável da seringa. O tubo da centrífuga é pré-preenchido com 10 mL de solução de cloreto de cálcio, permitindo que a solução de alginato que sai da ponta da seringa seja gelificada, formando bolas de gel de alginato. (C) Imagem microscópica representativa mostrando a morfologia das bolas de gel de alginato. (D) Imagem microscópica representativa mostrando a morfologia de bolas de gel de alginato contendo células HeLa. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Figura 4: Representação esquemática das etapas de preparação para medição de RMN e hiperpolarização. Durante o processo de acúmulo de DNP de ~ 60 minutos, a configuração de NMR é executada em paralelo para minimizar atrasos. A preparação envolve o carregamento do grânulo de alginato no tubo de RMN, seguido de ajuste de trava de 1H, calço e ajuste da sonda para garantir que o sistema esteja pronto para medição imediata. Após a dissolução e mistura in situ , a espectroscopia de RMN de 13C resolvida no tempo revela picos claros de piruvato e lactato. Os picos observados em aproximadamente 171 ppm, 179 ppm e 183 ppm correspondem a piruvato, hidrato de piruvato e lactato, respectivamente. Aproximadamente 4 × 107 células HeLa encapsuladas em gel de alginato foram usadas para a medição da RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Figura 5: Detecção resolvida no tempo de sinais de piruvato e lactato em medições repetidas. Espectros de RMN de 13C hiperpolarizados da mesma amostra encapsulada em células SCCVII foram adquiridos em intervalos de 1,5 h para avaliar a viabilidade de medições não destrutivas repetidas. As intensidades máximas de piruvato (círculos abertos) e lactato (círculos preenchidos, dimensionados em 1000×) são plotadas ao longo do tempo para cada aquisição. (A) Primeira medição. (B) A segunda medição, após 1,5 h, revela uma redução acentuada na produção de lactato. (C) A terceira medição, após mais 1,5 h, confirmou baixa atividade metabólica sustentada. A análise quantitativa baseada na área sob a curva (AUC) mostrou que a relação [Lactato]/[Piruvato] diminuiu de 0,00134 (primeira medição) para 0,00019 (segunda) e 0,00027 (terceira). A concentração final de células no gel de alginato foi de aproximadamente 1,0 × 107 células/mL (4 × 107 células em 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Figura 6: Conversão de piruvato em lactato em células HeLa. Sinais de RMN de 13C hiperpolarizados resolvidos no tempo de piruvato e lactato foram medidos em células HeLa vivas. A intensidade do sinal do piruvato é normalizada para seu valor máximo no tempo zero. A intensidade do sinal de lactato é dimensionada por um fator de 103 para visibilidade. A análise quantitativa baseada na área sob a curva (AUC) mostrou uma relação [Lactato]/[Piruvato] de 0,00121. A concentração celular final no gel de alginato foi de aproximadamente 7,5 × 106 células/mL (3 × 107 células em 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
Figura suplementar 1. Imagens representativas do septo do frasco usado no sistema do biorreator. (A) Septo de silicone/PTFE (9 mm de diâmetro) antes do uso. (B) O mesmo septo em uso real, com tubo PEEK inserido através de orifícios perfurados. A elasticidade do material do septo permite que ele vede novamente ao redor da tubulação, mantendo condições herméticas durante a injeção de substrato hiperpolarizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura</a>
Figura suplementar 2: Espectro de RMN de 13C hiperpolarizado resolvido no tempo adquirido após mistura externa. Espectro representativo resolvido no tempo do metabolismo do piruvato [1-13C] medido usando um sistema de RMN de bancada após mistura externa de piruvato hiperpolarizado e células fora do tubo de RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura</a>
Arquivo Suplementar 1: Projeto CAD do suporte cilíndrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo</a>

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O aumento da sensibilidade proporcionado pela polarização nuclear dinâmica de dissolução (DNP) permite acompanhar os processos metabólicos em tempo real por RMN e RM. As características e desempenhos de uma configuração DNP de dissolução dedicada projetada para estudar reações enzimáticas são discutidas.

Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

Um simulador dinâmico multicompartimental é usado para simular alguma biologia de interesse para estudos metabólicos usando agentes de ressonância magnética hiperpolarizada.

O uso de um compartimento Multi-dinâmica única enzima Fantasma de Estudos de hyperpolarized agentes Ressonância Magnética

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Nós apresentamos um protocolo para medir a dependência do campo magnético do tempo do abrandamento da girar-estrutura de 13C-compostos enriquecidos, hyperpolarizado por meio da polarização nuclear dinâmica, usando o relaxometry Field-Cycled rápido. Especificamente, temos demonstrado isso com [1-13C] piruvato, mas o protocolo pode ser estendido para outros substratos hiperpolarizados.

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-13C] piruvato

Este protocolo descreve a configuração de um bioreator NMR para manter as células humanas encapsuladas viáveis por até 72 h, seguida por aquisição e análise de dados NMR resolvidos no tempo. A metodologia é aplicada para monitorar interações proteína-ligantes intracelulares em tempo real.

Monitoramento de interações proteína-ligantes em células humanas por NMR quantitativo em tempo real usando um bioreator de alta densidade celular

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Nós desenvolvemos um citômetro de fluxo, utilizando ultra-som para detectar a laser induzida circulando células de melanoma como um indicador precoce de doença metastática.

Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

Aprenda a medir o metabolismo de piruvato em células vivas usando RMN de ¹³C hiperpolarizada. Este protocolo não destrutivo permite rastreamento em tempo real para estudos metabólicos e triagem de fármacos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada ^{de 13}C

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