Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada ^{de 13}C

Desenvolvemos um método não invasivo para medir o metabolismo sérico em tempo real usando técnicas avançadas de RMN hiperpolarizada. Nosso objetivo é criar ferramentas acessíveis para várias aplicações de pesquisa biológica. Vários sistemas de RMN hiperpolarizados para o metabolismo sérico foram relatados. No entanto, protocolos padronizados e reprodutíveis para implementação de pesquisa mais ampla não estavam disponíveis até agora.

Nosso protocolo melhora a acessibilidade usando componentes comerciais disponíveis. Também fornecemos validação abrangente, incluindo vantagens de mistura de sistemas e recursos de medição repetida para uma adaptação mais ampla. Nossos resultados permitem o rastreamento em tempo real de mudanças metabólicas dinâmicas em células vivas sem distração. Isso abre novas possibilidades para estudos de medicamentos de longo prazo em diversas aplicações de sondas metabólicas.

Nossa abordagem tem limitações, incluindo opções de problemas e requisitos de automação. A solução dos desafios estabelecerá técnicas de medição metabólica celular e enriquecerá os esforços de pesquisa DNP de nosso laboratório no futuro.

[Narrador] Para começar, adicione dois mililitros de solução de tripsina EDTA a 0,25% volume a volume a um prato de 10 centímetros. Incline o prato suavemente para garantir que toda a superfície esteja coberta. Em seguida, aspirar o excesso de solução de ácido etilenodiaminotetráctico de tripsina. Coloque o prato em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e incube por dois minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura ao prato. Usando uma pipeta, pipete suavemente para cima e para baixo para separar as células da superfície e coletar toda a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Agora pegue aproximadamente 10 microlitros da suspensão de células e carregue-a em um contador de células para determinar o número de células. Certifique-se de que a contagem medida confirme um rendimento de aproximadamente 10 milhões de células ou ajuste conforme necessário. Centrifugar a suspensão celular restante a 120 x g durante cinco minutos. Após centrifugação, aspirar e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular resultante em quatro mililitros de solução de alginato a 2% de peso para volume e pipete lentamente para minimizar a formação de bolhas. Agora adicione 10 mililitros de solução de cloreto de cálcio 50 milimolar a um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Fixe a seringa à tampa do tubo de centrifugação que contém a solução de cloreto de cálcio. Retire 300 microlitros da mistura de alginato celular em uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 10 milímetros de três calibres. Em seguida, feche bem o tubo da centrífuga com a seringa fixada na tampa e coloque o conjunto na centrífuga para girar suavemente a 200 x g por cinco minutos. Remover o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o gel resultante em meio de cultura. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, transfira o gel encapsulado em células para um tubo de RMN e insira o acessório de esponja para garantir uma vedação hermética. Pré-aqueça o reservatório médio contendo 5% de óxido de deutério volume a volume em banho-maria a 37 graus Celsius. Comece a circulação a uma taxa de aproximadamente 500 microlitros por hora para estabilizar as condições. Inspecione a configuração para garantir que não haja vazamentos antes de prosseguir. Adicione 18 microlitros de ácido pirúvico marcado com carbono 13 a uma concentração de 14,2 molares dopados com 25 milimolares OX063 a um frasco de amostra. Conecte o frasco ao caminho do fluido do sistema polarizador de polarização nuclear dinâmica. Em seguida, insira o frasco conectado na unidade de orifício do polarizador nuclear dinâmico. Aplique irradiação de microondas a aproximadamente 188 gigahertz com uma potência de 22 miliwatts por um período de 60 a 80 minutos. Use o espectrômetro de ressonância magnética nuclear de estado sólido integrado ao sistema de polarização nuclear dinâmica para monitorar a intensidade do sinal de carbono 13. Registre os dados do sinal a cada cinco minutos usando o software de controle do sistema. Agora dissolva rapidamente a amostra polarizada em 3,2 mililitros de tampão de dissolução pré-aquecido à temperatura biológica. Carregue a amostra preparada em um tubo de RMN e insira o tubo no espectrômetro. No console de RMN, inicie o procedimento automatizado para realizar bloqueio, ajuste, correspondência e calço com a amostra no lugar para garantir a resolução espectral ideal e a estabilidade do sinal. Carregue uma sequência de aquisição de pulso de carbono 13 com o desacoplamento de prótons habilitado usando uma configuração como 13-CPD. Defina o ângulo de inversão para 90 graus com um pulso de um microssegundo rotulado como P1. Em seguida, defina o tempo de aquisição como 1,376 segundos, a largura espectral como 23.663 hertz e os pontos de aquisição, ou TD, como 65.536. Defina o atraso de relaxamento D1 para zero segundos. Atribua 150 incrementos de tempo a TD1 para adquirir 150 espectros sequenciais no modo pseudo-2 dimensional e ajuste o ganho do receptor para um valor baixo, como aproximadamente um, para evitar a saturação do sinal causada pelas amostras hiperpolarizadas. Agora pare a bomba peristáltica para interromper temporariamente a circulação do meio antes de injetar a solução hiperpolarizada através da tubulação de entrada. Inicie a aquisição espectral aproximadamente 10 segundos antes de dissolver o substrato hiperpolarizado para garantir a captura do sinal na chegada ao local de detecção. Quando a solução sair do polarizador de polarização nuclear dinâmica, coloque um mililitro dele em uma seringa. Mude a válvula de três vias na entrada do biorreator para a posição B para direcionar a solução hiperpolarizada para o tubo de RMN. Após a conclusão da injeção, coloque a válvula de volta na posição A para retomar a circulação média e evitar qualquer refluxo. Finalmente, confirme se a injeção foi bem-sucedida após observar um aumento no sinal de decaimento de indução livre no software de aquisição. Certifique-se de que a solução final atinja uma temperatura entre 308 e 313 Kelvin e um pH de aproximadamente sete antes de transferir para medição de RMN. Espectros de RMN de carbono 13 hiperpolarizados da mesma amostra encapsulada em células SCCVII foram adquiridos em intervalos de 1,5 horas para avaliar a viabilidade de medições não destrutivas repetidas. A primeira medição de RMN mostrou um sinal de lactato acentuadamente aumentado, indicando conversão metabólica ativa de piruvato em lactato. Medições subsequentes em intervalos de 1,5 horas revelaram uma redução progressiva na intensidade do sinal de lactato, indicando diminuição da atividade metabólica ao longo do tempo. Nas células HeLa, as medições iniciais confirmaram a conversão bem-sucedida de piruvato em lactato com picos de sinal claramente discerníveis. Embora o sinal tenha diminuído gradualmente devido ao relaxamento do T2, a relação sinal-ruído permaneceu adequada ao longo da aquisição de 60 segundos, sugerindo que o protocolo atual é amplamente aplicável e pode servir como uma ferramenta versátil para perfis metabólicos em tempo real em vários tipos de células.