Germinação assibiótica e regeneração baseada em explante foliar da orquídea medicinal ameaçada de extinção Hemipilia cucullata a partir de sementes maduras

Minha pesquisa se concentra na otimização de protocolos de cultura de tecidos para orquídeas ameaçadas de extinção para melhorar a conservação, propagação em larga escala e utilização sustentável dessas valiosas plantas medicinais. Um grande desafio é alcançar taxas consistentes de germinação e regeneração entre as espécies de orquídeas, pois cada uma requer otimização de meio específica da espécie e o controle preciso das condições de crescimento. Desenvolvemos protocolos eficientes de cultura de tecidos para várias plantas ameaçadas de extinção, permitindo a recuperação de espécies e apoiando a reconstrução em habitats naturais.

Não existe um sistema eficiente de cultura de tecidos reprodutíveis para Hemipilia cucullata manuseando propagação, restauração e conservação. As orquídeas terrestres geralmente precisam de fungos simbióticos específicos cujo isolamento e identificação são complexos. Um método simbiótico simplifica a propagação e ignora essas etapas.

Nossa prática permite alta germinação e rápida regeneração de plantas a partir de estados maduros, eliminando a dependência de fungos e oferecendo uma abordagem mais rápida e confiável para a propagação de Hemipilia cucullata. Para começar, coloque a cápsula em um béquer. Adicione uma a duas gotas de detergente no copo para enxaguar.

Lave a cápsula em água corrente da torneira por cinco minutos. Em seguida, usando papel absorvente estéril, remova a água superficial restante da cápsula. Agora, mergulhe a cápsula em etanol a 75% por 30 segundos.

Esterilize a cápsula mergulhando-a em 50 mililitros de solução de hipoclorito de sódio a 20% contendo aproximadamente 5% de cloro disponível. Em seguida, adicione duas gotas de detergente doméstico não diluído à solução e incube a cápsula por 10 a 12 minutos. Enxágue a cápsula cinco vezes com água destilada estéril para remover qualquer desinfetante residual.

Em seguida, usando um bisturi estéril, remova aproximadamente um milímetro das extremidades do ápice e do pedicelo da cápsula. Faça uma pequena incisão na extremidade superior da cápsula para expor as sementes e coletá-las em uma placa de Petri estéril. Usando uma pinça estéril, disperse uniformemente aproximadamente 500 a 600 sementes em cada frasco de cultura contendo o meio preparado.

Deixe as sementes absorverem água e se depositarem no fundo do meio líquido. Mantenha as culturas a 25 graus Celsius com um ciclo de luz e escuridão de 12 horas e uma intensidade de luz de 36 micromoles por metro quadrado por segundo. Observe a germinação das sementes semanalmente.

Registre quaisquer alterações morfológicas visíveis e fotografe as culturas para documentação. Selecione mudas saudáveis de um a dois centímetros de tamanho sem escurecimento visível ou amarelecimento completo para alongamento dos brotos. Usando uma pinça esterilizada e resfriada, transfira assepticamente 8-12 mudas para cada frasco contendo meio de alongamento de brotos recém-preparado.

Distribua uniformemente as mudas dentro de cada garrafa. Após cinco semanas de alongamento da parte aérea, selecione plântulas com brotos totalmente desenvolvidos e folhas saudáveis para amostragem de explante foliar. Extirpar as folhas estéreis totalmente expandidas de uma plântula saudável usando o bisturi estéril.

Remova a região apical e as margens das folhas. Em seguida, corte cada folha em segmentos de aproximadamente 0,5 por 0,5 centímetro usando um bisturi estéril em condições assépticas. Coloque 10 segmentos de folha no meio de indução PLB com a superfície adaxial voltada para cima.

Certifique-se de que cada segmento toque o meio com firmeza. Em seguida, cultive-os por cinco semanas. Finalmente, avalie o número de PLBs induzidos com sucesso e calcule a taxa de indução como uma porcentagem.

Registre a altura média dos botões em centímetros e conte o número de botões formados por explante. A germinação das sementes em meio líquido foi visivelmente caracterizada pela emergência de embriões verdes do tegumento por volta dos 60 dias, que posteriormente formaram protocormos esféricos por 80 a 85 dias. A maior taxa de germinação de 72% foi alcançada em meio líquido suplementado com 0,5 miligramas por litro de ANA.

O meio B5 contendo 0,5 miligramas por litro de benziladenina e 0,2 miligramas por litro de NAA produziu a maior taxa de proliferação de protocormos, com média de 5,3 protocormos recém-formados por explante. Os protocormos cultivados em meio B5 com a combinação otimizada de reguladores de crescimento apresentaram crescimento vigoroso e pigmentação verde saudável, superando aqueles cultivados em meio MS nas mesmas condições. O maior número de ramos por plântula, com média de quatro, foi observado com um miligrama por litro de cada benziladenina e ANA, seguido de perto pelo NAA sozinho com 0,5 miligrama por litro.

O alongamento da parte aérea foi mais aprimorado com a combinação de 0,5 miligramas por litro de benziladenina e um miligrama por litro de NAA, resultando em uma altura média de plântulas de 4,8 centímetros. A maior taxa de indução de corpos semelhantes a protocormos 44,3% foi alcançada usando três miligramas por litro de benziladenina com 0,2 miligramas por litro de NAA.