Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

Nossa pesquisa explora a meiose vegetal, com o objetivo de desvendar mecanismos moleculares que orientam o reconhecimento, alinhamento e pareamento homólogo dos cromossomos durante a progressão meiótica. O desafio é visualizar o movimento cromossômico em perfis meióticos, exigindo imagens de tecidos vivos com alta resolução e velocidade para acompanhar trajetórias. Para começar, remova a película protetora do espaçador de um lado e coloque-a no centro de uma lâmina de vidro.

Depois, remova a segunda película protetora. Deposite oito microlitros de água da torneira no centro do espaçador. Usando pinças, colha uma inflorescência de um dos caules principais.

Coloque a inflorescência em uma nova lâmina posicionada sob um microscópio estereoscópico equipado com uma régua. Selecione botões florais que medam aproximadamente 0,5 milímetros de comprimento. Usando agulhas afiadas, abra suavemente os botões separando as sépalas e pétalas para manter apenas as anteras.

Transfira delicadamente os cachos de antera para a água na cavidade espaçadora imediatamente após remover as sépalas e pétalas para evitar a desidratação. Deposite vários outros cachos dentro da cavidade do espaçador. Para cobrir o slide com uma cobertura e evitar bolhas de ar, adicione oito microlitros de água sobre uma cobertura de tampon.

Depois, inverta cuidadosamente o deslize da tampa com a gota d'água voltada para a cavidade do espaçador. Certifique-se de que os cachos das anteras estejam imersos em um total de 16 microlitros de água e que o deslizamento da tampa adera bem ao espaçador. Instale o microscópio excitando GFP a 488 nanômetros e detectando-o com um detector híbrido entre 494 e 547 nanômetros.

Depois, localize a antera usando iluminação em campo claro. Usando o canal de campo claro, determine o estágio meiótico com base no formato das células. Visualize a antera no software e use o sinal RFP como um indicador adicional do estágio meiótico das células.

Para realizar aquisições contínuas, defina o intervalo de tempo a zero na seção de tempo. Depois, use o módulo de manchas para rastrear automaticamente as manchas. Escolha o canal fonte verde e defina o diâmetro XY para um micrômetro para o centrômero marcado por GFPCENH3.

Depois, modifique a qualidade da detecção com base na intensidade do sinal usando o gráfico na parte inferior da janela de controle. Use o algoritmo de rastreamento de movimento regressivo automático para traçar trajetórias do centrômero e visualizar todas as trajetórias para distinguir facilmente meiócitos de tecidos somáticos. Em seguida, use o módulo de pontos para acompanhar os pontos ao longo do tempo no núcleo selecionado.

Defina uma região de interesse selecionando o segmento de opção apenas como uma região de interesse e realize o acompanhamento spot dentro dele. Selecione uma região de interesse que inclua propriamente o núcleo em todas as três dimensões e ao longo do tempo. Em um gráfico de linhagem, use o visualizador 3D do software para visualizar todas as trajetórias.

Remova as trajetórias fora do meócito analisado selecionando-as e pressionando a tecla delete no teclado. No modo de edição, exclua ou adicione um objeto, garantindo que o objeto seja adicionado no plano correto. No modo de editar trilhas, conecte manualmente os novos objetos no gráfico de linhagem após analisar cuidadosamente a célula em 3D.

Calcule a velocidade instantânea em cada passo de tempo para monitorar variações na velocidade de movimento ao longo do tempo. Calcule o ângulo de giro como a mudança na direção do movimento entre passos consecutivos de tempo para revelar padrões de trajetória. Armazene o resultado junto com a velocidade instantânea.

Calcule a razão de alcance usando o cell tracker para medir o quanto um objeto rastreado se move em relação à sua posição inicial, indicando comportamento exploratório. Calcule a velocidade média de cada trilha para resumir as características de movimento ao longo do período de observação. Calcule o ângulo médio de curva por trilho para analisar movimento, direcionalidade e padrões comportamentais e armazene o resultado.

Em seguida, calcule o tamanho do centróide em cada passo temporal para medir a dispersão espacial dos centrômeros em torno de sua posição média. Use variações no tamanho do centroide ao longo do tempo para avaliar a consistência global entre as trilhas do centrómero e armazenar o resultado. Calcule a correlação cruzada de velocidade para analisar as relações entre a dinâmica de movimento de diferentes objetos rastreados, revelando potenciais comportamentos coordenados.

Depois, calcule o deslocamento quadrático médio para cada trajetória para quantificar a distância quadrada média percorrida pelos centrômeros em um dado intervalo de tempo. Os centrômeros meióticos apresentaram uma velocidade média significativamente maior de 109,35 nanômetros por segundo em comparação com os centrômeros somáticos. Os centrômeros meióticos apresentaram uma faixa mais ampla e maior índice de alcance normalizado em comparação com os centrômeros somáticos.

A distribuição dos ângulos de viragem diferia entre centrômeros meióticos e somáticos. O deslocamento quadrático médio dos centrômeros meióticos aumentou ao longo do tempo, enquanto os centrômeros somáticos permaneceram em grande parte estáticos. Esse protocolo permitiu a quantificação inicial do movimento cromossômico meiótico em Arabidopsis, revelando dinâmicas dramáticas dos centrômeros durante os estágios de zigoteno-paquiteno.

Esse protocolo permite estudar os movimentos das regiões genômicas durante a prófase meiótica e pode ser adaptado para aplicação em outras espécies de plantas. Esses trabalhos permitem a exploração do movimento cromossômico e da interação de recombinação, aprofundando a compreensão dos mecanismos que impulsionam a diversidade genética durante a formação de gametas das plantas.