Name: Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a superexpressar e purificar a nuclease tóxica Nsp15 de Escherichia coli usando cromatografia de afinidade e exclusão por tamanho. Este método viabiliza estudos bioquímicos e estruturais de proteínas tóxicas de nidovírus.

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<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Kato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+low+leakage+expression+systems+using+dual+transcriptional-translational+control+for+toxic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).</li>
<li>Dubendorf, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+lysozyme+to+improve+an+inducible+T7+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.</a> J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
<li>James, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+over-expression+in+Escherichia+coli+triggers+adaptation+analogous+to+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance.</a> Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+the+endoribonuclease+function+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+nsp11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11.</a> J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).</li>
<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
<li>Joseph, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+monomeric+form+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endonuclease+nsp15+suggests+a+role+for+hexamerization+as+an+allosteric+switch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch.</a> J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+target+revealed+by+the+hexameric+structure+of+mouse+hepatitis+virus+nonstructural+protein+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15.</a> J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endoribonuclease+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15.</a> J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
<li>Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+on+Co2%2B+carboxymethylaspartate-agarose+Superflow%2C+as+demonstrated+by+one-step+purification+of+lactate+dehydrogenase+from+chicken+breast+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle.</a> Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).</li>
<li>Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turkey+coronavirus+non-structure+protein+NSP15+-+an+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease.</a> Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).</li>
<li>Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+E.+coli+expression+strain+LOBSTR+eliminates+common+contaminants+from+His-tag+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification.</a> Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).</li>
<li>Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+highly+toxic+genes+in+E.+coli%3A+special+strategies+and+genetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools.</a> Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).</li>
<li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+and+crystallographic+fragment+screening+of+SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).</li>
<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m PES, Esterilização, Baixa Ligação a Proteínas, Sistema de Filtro, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de serina protease AEBSF</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>Amresco</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA vai sistema de purificação</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa Concentrador MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Goldbio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de agitação defletores</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>Biofotômetro plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de corante Bradford</td><td>Boston BioProdutos</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Banho seco digital</td><td>Bio Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Espalhadores descartáveis, em forma de L</td><td>Parceiros MedSupply</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI de pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de lenços de papel Douce, 40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de crotacografia em coluna econo-coluna</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Misturador nutating minimix Enduro</td><td>Contato Labnet</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R Inc/Ref Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Contato Labnet</td><td>Pág. 2000</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo Fiberlite F10-4x1000 LEX</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo Fiberlite F21-8x50y</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa quente</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Goldbio</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-szlig;-D-tiogalactiosídeo (IPTG)</td><td>Goldbio</td><td>12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Células de E. coli competentes para Lemo21 (DE3)</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (II) tetra-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,7 mL</td><td>Parceiros MedSupply</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Célula de eletroforese vertical tetra PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Géis de trisglicina miniproteana, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge mini centrfuge</td><td>Parceiros MedSupply</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de centrífuga super-rápida Nalgene 1 L</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga Nalgene oak ridge</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotômetro</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora sem vibração</td><td>Contato Labnet</td><td>I 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Superexpressar células C41 (DE3) quimicamente competentes</td><td>Tecnologias de Biopesquisa</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Superexpressar células C41 (DE3) quimicamente competentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Descontinuado; As células Biosearch C41(DE3) ou células NEB Lemo21 são uma alternativa</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Parceiros MedSupply</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeos (backbone pET-14b)</td><td>Genscript</td><td>Pedido personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Micro-cubetas de plástico</td><td>Fisher Científico</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPacfonte de alimentação universal</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Agulha deslizante de precisão</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Padrões de precisão mais proteína não corada</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Meio de recuperação para expressão&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de caçamba oscilante S-4x1000</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 10 mL</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 5 mL</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Desmembrador sônico</td><td>Fisher Científico</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Lynx 4000</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Spephadex G-25 M PD-10</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>-Mercaptoetanol</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Copo de aço inoxidável Griffin</td><td>Louça Polar</td><td>13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon estéreis, 15 mL</td><td>Falcão</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon estéreis, 50 mL</td><td>Falcão</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Superdex 200 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Seringas, 1 mL</td><td>Tempo de ar</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Seringas, 3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Resina de afinidade metálica TALON</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Palitos</td><td>Rua da Criatividade</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Tritão X-100</td><td>MP Biomédicos</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Ponto de referência</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>Y20025</td><td></td></tr></tbody></table>

superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

Devido à toxicidade de Nsp15 como nuclease, um total de ~ 7 h era geralmente necessário para que as culturas iniciais atingissem um OD600 de 0,8-1,0. Uma vez inoculado, um total de ~ 3-5 h era normalmente necessário para o mesmo OD600 ideal de 0,8-1,0 para indução. Nesse caso, o tempo de duplicação parecia ser ~ 1 h. Quando um mutante morto catalítico de Nsp15 foi expresso, a duplicação para as células de E. coli parecia normal (~ 20 min), mais uma evidência de que a atividade da nuclease é...

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

A co-expressão de proteínas é uma alternativa poderosa para a reconstituição in vitro de complexos proteicos e auxilia na realização de testes bioquímicos e genéticos in vivo. Aqui relatamos o uso da co-expressão de proteínas em Escherichia coli para obter complexos proteicos e ajustar a frequência de mutação das células.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia   Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.

Sobreexpressão e purificação do ser humano Cis -preniltransferase em Escherichia coli

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Aprenda a superexpressar e purificar a nuclease tóxica Nsp15 de Escherichia coli usando cromatografia de afinidade e exclusão por tamanho. Este método viabiliza estudos bioquímicos e estruturais de proteínas tóxicas de nidovírus.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

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