Extração de histonas de amostras clínicas para perfilamento epigenético por espectrometria de massa

O escopo da nossa pesquisa é analisar mudanças epigenéticas em amostras de câncer, descobrir novos biomarcadores diagnósticos e prognósticos, e identificar possíveis alvos para terapia. Um grande desafio com amostras clínicas é o material limitado e os artefatos induzidos pela fixação. No entanto, com nosso fluxo de trabalho otimizado e sensibilidade di, podemos quantificar até 50 PTMs de histonas a partir de apenas 1000 células.

Mostramos que a espectrometria de massa pode quantificar alterações PTM de histonas em amostras clínicas, oferecendo insights sobre o mecanismo epigenético e possibilitando a descoberta de biomarcadores e a identificação de alvos de fármacos para terapias epigenéticas de precisão. Nosso protocolo atende à necessidade de perfilamento robusto, quantitativo e sensível na PTM de histonas em vários tipos de amostras clínicas. A espectrometria de massa é ideal para análise PTM de histonas, oferecendo detecção não enviesada, perfilamento simultâneo e coocorrência no mesmo peptídeo, superando assim as limitações dos métodos baseados em anticorpos.

Para começar, descongele o tecido fresco congelado no gelo e, usando um bisturi ou lâmina, corte um pedaço de aproximadamente 20 a 30 miligramas correspondente a cerca de dois milímetros cúbicos de tecido. Transfira a amostra de tecido cortada para um tubo de 1,5 mililitro. Usando tesoura, triture o papel em pedaços pequenos.

Adicione um mililitro de tampão de isolamento de núcleos recém-preparado, suplementado com os inibidores de protease especificados, e triture novamente o tecido. Transfira a amostra para um homogeneizador descendente. Usando primeiro o pilão solto e depois o pilão apertado, homogeneize o tecido até que não restem pedaços visíveis a olho nu.

Filtre a amostra homogeneizada por um filtro de células de 100 micrômetros para eliminar detritos de tecido. Pipete vigorosamente a amostra filtrada para cima e para baixo usando uma pipeta de 200 microlitros para dissolver a membrana plasmática. Transfira a amostra para um novo tubo de 1,5 mililitro.

Coloque o tubo em uma centrífuga de bancada e gire a 2.300 G por 15 minutos a quatro graus Celsius para fazer pellets nos núcleos. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet nuclear em 50 a 100 microlitros de tampão de isolamento de núcleos, suplementado com 0,1% de SDS para dissolver a membrana nuclear. Depois, adicione 250 unidades de nuclease de Benzonase à amostra ressuspensa para digerir os ácidos nucleicos.

Misture bem e incube por dois minutos a 37 graus Celsius. Para a temperatura ideal de corte, amostras congeladas, lave os tecidos com água com etanol e PBS antes de moer e extrair as histonas. Adicione um mililitro de agente dissolvente de parafina à amostra de FFPE, coletada em um tubo de 1,5 mililitro e faça vórtice na velocidade máxima por 30 segundos até que a parafina esteja completamente dissolvida.

Centrifuge a amostra a 16.000 G por três minutos em temperatura ambiente e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta equipada com uma ponta pequena, evitando o pellet. Agora adicione um mililitro de etanol 95% ao pellet e ao vórtice na velocidade máxima por 30 segundos. Centrifuge a amostra a 16.000 G por três minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.

Após reidratar a amostra, adicione 200 microlitros de tampão de extração ao pellet. Homogeneize o tecido no tampão de extração fornicando com um significante digital usando uma ponta micro de três milímetros. Após a homogeneização, incube a amostra em um misturador térmico e abra brevemente a tampa do tubo para permitir a evaporação do formaldeído.

Após centrifugar a amostra, transfira o sobrenadante para um novo tubo rotulado. Retire as bandas de gel correspondentes ao peso molecular das proteínas histonas centrais localizadas entre 10 e 18 kilodaltons usando um bisturi. Após cortar as pulseiras de gel, use o mesmo bisturi para transferir as peças de gel cortadas para um tubo de 1,5 mililitro.

Para eliminar o gel, adicione uma solução de 50% de acetonitrila em água dupla destilada e incube o tubo em um misturador térmico a 1.400 rotações por minuto por 10 minutos em temperatura ambiente. Desidrate as peças de gel adicionando 100% acetonitrila. Misture no misturador térmico a 1.400 rotações por minuto por 10 minutos em temperatura ambiente.

Após descartar o sobrenadante, seque as peças de gel por cinco minutos em temperatura ambiente em uma centrífuga a vácuo. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução de proponicicanhidrido de 7,7 molares e 26 microlitros de um molar de bicarbonato de amônio em cada tubo e incube. Em seguida, incube a amostra com 80 microlitros de bicarbonato de amônio molar de um molar.

Depois, lave as peças de gel três vezes com água destilada em dobro e descarte o líquido após cada incubação. Em seguida, adicione 50% de acetona nitrila aos pedaços de gel e incube a 1.400 rotações por minuto por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois adicione 100% de acetonitrila para desidratar completamente as partes do gel.

Incube no misturador térmico a 1.400 rotações por minuto por 15 minutos à temperatura ambiente. Após descartar o líquido, seque as peças de gel por cinco minutos em temperatura ambiente em uma centrífuga a vácuo. Adicione quatro microlitros de solução de tripsina e 20 microlitros de buffer de digestão a cada tubo contendo pedaços de gel.

Incube os tubos no gelo por 10 minutos para permitir a absorção da tripsina no gel. Quando a tripsina for totalmente absorvida, adicione 80 microlitros de tampão de digestão para cobrir completamente as partes do gel e incube os tubos durante a noite a 37 graus Celsius em um misturador térmico. Para extrair os peptídeos digeridos, adicione 100 microlitros de nitrila 100% aceto a cada tubo e incube a 1.400 rotações por minuto por 20 minutos em temperatura ambiente em um misturador térmico.

Agora, colete cuidadosamente o sobrenadante e transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro. Após repetir a extração de nitro aceto com o gel restante, agrupe os supernatantes. Concentre os peptídeos agrupados em uma centrífuga a vácuo até que o volume esteja entre um e cinco microlitros.

Depois, adicione dois microlitros de um molar de bicarbonato trietilamônio e três microlitros de solução de fenoi-isocianato. Incube a amostra a 350 rotações por minuto por 90 minutos a 37 graus Celsius em um misturador térmico. Para interromper a derivização, adicione oito microlitros de ácido 1% tricloroacético a cada tubo.

Por fim, dilua cada amostra adicionando 100 microlitros de tampão A e carregue as amostras diluídas nas pontas do estágio C18 para elução. A extração de histonas foi realizada com sucesso a partir de amostras frescas congeladas, OCT congeladas e FFPE, utilizando fluxos de trabalho diferenciais de processamento específicos para cada tipo de tecido. Apesar do menor enriquecimento e presença de proteínas de fundo, as histonas H3, H2A, H2B e H4 foram extraídas com sucesso de amostras de FFPE, conforme mostrado pelas bandas nos FFPE1 e FFPE2 de Lane, alinhando-se com aproximadamente um micrograma do padrão H3.1.

Nano cromatografia líquida e análise em esclerose múltipla de histonas derivadas do FFPE mostraram separação bem-sucedida dos péptidos de histonas ao longo de um gradiente de 55 minutos, com picos claros de tempo de retenção mostrados no cromatograma iônico total. Cromatogramas iônicos extraídos confirmaram a detecção e quantificação de formas não modificadas e metiladas de H3 K 4, com perfis de elução separados para cada valor M por Z. Possibilitando o cálculo da porcentagem de abundância relativa para cada modificação.

A análise comparativa das modificações das histonas entre amostras normais e tumorais revelou aumentos significativos em certos tipos e diminuição em outros tipos nos tecidos tumorais.