Name: Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a usar ferramentas de optogenética LEXY e LINuS com análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas. Este método oferece insights sobre mecanismos celulares.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).</li>
<li>Beyer, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+light-regulated+reversible+nuclear+localization+of+proteins+in+mammalian+cells+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).</li>
<li>Niopek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-inducible+nuclear+localization+signals+for+precise+spatiotemporal+control+of+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells.</a> Nat Commun. 5, 4404(2014).</li>
<li>Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+export%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein export.</a> Nat Commun. 7, 10624(2016).</li>
<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt%2C+U+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention+-+MICCAI+2018%22">Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018</a>. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).</li>
<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nat Commun. 6, 8497(2015).</li>
<li>Kudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomycin+B+inactivates+CRM1%2Fexportin+1+by+covalent+modification+at+a+cysteine+residue+in+the+central+conserved+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).</li>
<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
<li>Kögler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
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A importância do transporte nucleocitoplasmático (NCT) para regular as principais vias celulares e manter a homeostase celular tem sido bem estudada nos últimos anos1. Em conseqüência, várias ferramentas foram geradas para estudar a dinâmica das NCTs 2,3,4. Entre essas ferramentas, as sondas optogenéticas LINuS5 e LEXY6, publicadas respectivamente em 2014 e 2016, fornecem uma maneira poderosa de monitorar NCT em células vivas. Essas ferramentas, projetadas para seguir a exportação induzível (LEXY) ou importação (LINuS) de um repórter fluorescente, são induzíveis pela exposição à luz azul e reversíveis.
Em resumo, essas duas pequenas sondas usam as propriedades do domínio LOV2 da proteína fototropina-1 da planta Avena sativa7. Na ausência de luz azul, a hélice Jα do domínio LOV2 é fotoenjaulada e incorporada ao núcleo da proteína. Como a hélice Jα pode responder ao estímulo de luz, a iluminação por luz azul induz uma mudança conformacional e o subsequente desacoplamento da hélice Jα do domínio LOV2. Os autores do LEXY e do LINuS usaram essa sensibilidade à luz para fundir um Sinal de Localização Nuclear (NLS) ou um Sinal de Exportação Nuclear (NES) à hélice Jα, para LINuS e LEXY, respectivamente (Figura 1). A ferramenta resultante é uma sonda que se transloca para o núcleo (LINuS) ou para o citosol (LEXY) após a iluminação da luz azul.
Para rastrear as sondas com imagens fluorescentes, um repórter fluorescente mCherry também foi adicionado às construções. Finalmente, um NES fraco (para LINuS) ou NLS (para LEXY) foi adicionado ao sistema para garantir que as sondas não estivessem em sua localização final antes da iluminação da luz azul, o que impediria a observação da translocação LEXY ou LINuS entre o núcleo e o citosol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Figura 1: Representação das sondas LEXY e LINuS. Ambas as sondas consistem em uma proteína mCherry fundida ao domínio LOV2 sensível à luz. A diferença entre as duas ferramentas reside na sequência de sinalização oculta pela hélice Jα: um NES para LEXY e um NLS para LINuS. Ambas as sondas também possuem uma sequência de sinal fraca para controlar sua localização inicial: um NLS fraco para LEXY e um NES fraco para LINuS. A ativação dos sistemas por iluminação de luz azul, portanto, induz sua exportação para LEXY ou sua importação para LINuS, permitindo que os usuários monitorem a exportação ou importação nuclear. Abreviaturas: LEXY = sistema de exportação nuclear induzido por luz; LINuS = sinal de localização nuclear induzível por luz; NLS = sinal de localização nuclear; NES = sinal de exportação nuclear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A localização da fluorescência mCherry relata o transporte das sondas LEXY e LINuS entre os núcleos e o citosol e, portanto, pode ser acompanhada em imagens de células vivas, permitindo que os usuários monitorem o NCT. Além de serem usados como sondas simples, LEXY e LINuS também podem ser projetados para controlar a localização e estudar proteínas de interesse, in vitro 5,6,8,9 ou in vivo 10,11.
O método de quantificação proposto nas publicações LEXY e LINuS mostra a intensidade nuclear relativa das sondas. A análise sugerida é feita manualmente e depende da medição de uma Região de Interesse (ROI) no núcleo e no citosol. Embora esse método forneça uma boa representação do sinal da sonda ao longo do tempo, ele é muito longo e tedioso, especialmente quando experimentos e condições são repetidos. É importante ressaltar que esse método também carece de precisão, pois apenas uma pequena parte do compartimento projetado é representada.
Aqui propomos um novo protocolo para quantificação de sinais fluorescentes LEXY e LINuS. Implementamos técnicas automatizadas, que facilitam as análises e proporcionam maior precisão. Isso facilitará o processo para novos usuários dessas ferramentas e ajudará a aumentar a taxa de transferência. Nosso protocolo de quantificação usa apenas uma interface, o plug-in TrackMate12 de código aberto da FIJI. Notavelmente, para melhorar a confiabilidade das quantificações, usamos um marcador de DNA vermelho distante compatível com imagens ao vivo para realizar a segmentação de todo o núcleo com StarDist13, uma rede neural convolucional treinada, combinada com rastreamento e medição do sinal fluorescente da sonda com TrackMate12.
Os dados obtidos podem então ser facilmente exportados para a planilha fornecida e pronta para uso (Tabela Suplementar S1) para obter a intensidade nuclear relativa de cada núcleo identificado. Este protocolo também explica como agrupar os valores obtidos em um gráfico ajustando a curva de curso de tempo obtida a um modelo monoexponencial, como em Yoo e Mitchison14 e como calcular a taxa de transporte para as diferentes condições testadas. Com este protocolo e a planilha fornecida para análise, os usuários poderão quantificar facilmente os dados de imagem de células vivas, mesmo com habilidades limitadas de bioinformática.

<table><tbody><tr><td>Colagénio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Distinguir-se</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>FIJI</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Placas fluoradas</td><td>Dutscher</td><td>Rolamento FD3510-100</td><td>Alternativa: Câmara de attofluor (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomicina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo LEXY</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>Plasmídeo LINuS</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Pencillin-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM livre de vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>Espirocromo</td><td>SC007</td><td>Alternativa: SPY-DNA650 (Espirocromo #SC501)</td></tr><tr><td>Plugin Stardist 2D</td><td>StarDist</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>Plug-in TrackMate</td><td>Companheiro de Trilha</td><td></td><td>Companheiro de Trilha-7.14.0</td></tr></tbody></table>

usando ferramentas de optogenética lexy e linus e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

O protocolo acima mencionado deve permitir que os usuários visualizem a localização e a translocação da sonda durante a aquisição em imagens de células vivas. Um exemplo das imagens esperadas adquiridas para visualizar a exportação nuclear com LEXY é mostrado na Figura 4. Uma rápida diminuição do sinal do núcleo e um enriquecimento no citosol devem ser observados após algumas rodadas de iluminação de luz azul. Uma recuperação progressiva do sinal da sonda pode ser visível após a interrupção dos ciclos de iluminação. Para controlar o sistema, a leptomicina B, um inibidor de exportação, atesta que uma mudança na exportação pode ser visualizada com as análises, pois impede que o LEXY seja exportado com iluminação de luz azul (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Figura 4: Visualização do sinal de LEXY ao longo do tempo. Captura de pontos de tempo representativos das fases estável, de iluminação e de recuperação, adquiridos com imagens de células vivas. A condição de metanol representa a condição de controle. Após a iluminação pulsátil da luz azul, em vermelho, o sinal fluorescente mCherry, repórter da localização do LEXY, é translocado do núcleo para o citosol. Depois de parar a iluminação, o sinal é recuperado no núcleo. O tratamento com o inibidor de exportação Leptomicina B a 1 nM ou 0,5 nM mostra a ausência ou diminuição da exportação de LEXY quando a exportação é bloqueada. Barra de escala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Em relação às análises, enquanto os valores da curva de intensidade nuclear relativa durante a fase estável devem estar em torno de 1, após a ativação da luz azul, eles devem apresentar uma diminuição lenta até atingir um platô no final da fase de iluminação (Figura 5A). Se a diminuição for muito rápida ou muito lenta, os parâmetros de aquisição podem ser otimizados (veja a discussão). O tratamento com leptomicina B em concentrações suficientes também pode confirmar que as análises e a técnica são sensíveis o suficiente para mostrar que a exportação nuclear está completamente bloqueada, com valores relativos de intensidade nuclear estáveis em torno de 1 para todo o experimento. As concentrações intermediárias de leptomicina B, no entanto, devem exibir uma exportação nuclear leve (Figura 5A). Estas observações visuais devem ser confirmadas quantitativamente com a obtenção da taxa de exportação (figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Figura 5: Intensidade nuclear relativa esperada de LEXY e taxa de transporte. (A) O gráfico representa a intensidade nuclear relativa do sinal fluorescente de LEXY ao longo do tempo, normalizada para a intensidade média mCherry da fase estável. A intensidade nuclear relativa da condição de metanol (controle, vermelho) diminui pela metade após a iluminação, em contraste com as células tratadas com o inibidor de exportação Leptomicina B, na concentração de 0,5 nM (azul claro) ou 1 nM (azul escuro). Barras de erro: MEV. (B) Taxa de exportação das condições controle e Leptomicina B, obtida pelo ajuste da curva a um modelo monoexponencial. Os valores obtidos quando a exportação é bloqueada pela leptomicina B são significativamente menores do que a condição de controle. N = 18 células para metanol (vermelho), 19 células para leptomicina B 0,5 nM (azul claro) e 15 células para leptomicina B 1 nM (azul escuro). Os valores de p foram calculados por um teste t de Welch bilateral. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar S1: Planilha com cálculos pré-definidos. Esta planilha é fornecida para facilitar a análise. Os valores de intensidade obtidos com o TrackMate podem ser copiados e colados diretamente na planilha para obter os valores de intensidade nuclear relativa normalizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar S2: Exemplo dos resultados esperados para uma condição de controle da análise de LEXY. A planilha representa um exemplo dos valores obtidos para uma condição de controle da linhagem celular estável de LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Nosso laboratório estuda a interação entre os poros nucleares e a organização da cromatina. Portanto, estudamos como os poros nucleares afetam a organização da cromatina, mas também inversamente se a organização da cromatina afeta a função dos poros nucleares, especialmente no transporte nucleocitoplasmático. O transporte nucleocitoplasmático é um processo muito rápido, portanto, um desafio é detectar mudanças na dinâmica do transporte nucleocitoplasmático em células vivas.Não há muitas ferramentas disponíveis para monitorar o transporte nucleocitoplasmático em células vivas. Ao implementar uma técnica semiautomatizada e aprimorada, esperamos facilitar o uso dessas ferramentas. Nosso protocolo é baseado em aprendizado profundo.Limita o erro e reduz muito o tempo necessário para a análise. O que antes levaria um dia agora leva apenas uma ou duas horas. Para começar, inicie o software FIJI no sistema do computador.Selecione a fase estável como imagem um, a fase de iluminação como imagem dois e a fase de recuperação como imagem três. Concatene as três imagens que representam três fases para produzir uma única imagem. Salve a imagem mesclada obtida para segmentação navegando até Arquivo e selecionando Salvar como TIFF.Em seguida, divida o canal mCherry selecionando Imagem, Cor e Dividir canais. Em seguida, salve a imagem dividida acessando Arquivo, Salvar como e TIFF. Para verificar se há branqueamento durante a aquisição, selecione sequencialmente Imagem, Pilhas e Plotar perfil do eixo Z.Em seguida, clique em Dados, seguido de Copiar primeiro conjunto de dados e cole-o na planilha fornecida na célula de perfil do eixo Z. Agora desenhe uma região circular de interesse, aproximando o tamanho médio de um núcleo, clicando em Analisar, seguido de Ferramentas e clicando em ROI Manager. Adicione o ROI e salve-o navegando até Mais e clicando em Salvar.Coloque o ROI salvo em uma região livre de células durante o lapso de tempo. Certifique-se de que o valor médio de cinza" esteja selecionado em Analisar e definir medições. Em seguida, clique em Mais, Multi Measure.Marque Medir todas as 50 fatias"e Um ROI por fatia"e clique em OK para registrar a intensidade. Copie e cole todos os valores de intensidade medidos na planilha fornecida na célula de fundo do ROI. Em seguida, feche a imagem apenas com o canal mCherry e selecione a imagem salva com canais mesclados.Agora abra o plug-in TrackMate clicando sequencialmente em Plugins, Tracking e TrackMate. Confirme se os pontos de tempo variam de zero a 49 e clique em Avançar. Selecione o detector StarDist e clique em Avançar.Escolha o canal dois, SiR-DNA, para segmentação de núcleos e aguarde a conclusão do processo. Deixe os parâmetros padrão na janela de limite e clique em Avançar. Crie filtros usando Intensidade média, Canal Um, para excluir núcleos com valores extremos de sinal.Crie um filtro para selecionar valores acima do limite definido e outro para selecionar os valores abaixo do limite. Da mesma forma, adicione dois filtros de área para remover detritos ou células mortas e clique em Avançar. Escolha o rastreador LAP simples e clique em Avançar.Em seguida, ajuste os parâmetros de rastreamento. Defina a distância máxima de vinculação "para 30 micrômetros, a distância máxima de fechamento de lacuna" para 15 micrômetros e a folga máxima do quadro de fechamento de lacuna" para três. Em seguida, clique em Avançar.Após os cálculos, clique em Avançar para definir filtros nas trilhas. Para selecionar apenas os núcleos que foram rastreados durante todo o curso de tempo, escolha o maior número de pontos no rastreamento e clique em Avançar. Em seguida, marque Exibir nomes de pontos "para refazer cada núcleo em análises posteriores e personalizar outros recursos de exibição conforme preferir.Na parte inferior da página, clique em Trilhas e escolha Exportar para CSV"para salvar a tabela de medição. Feche a tabela e prossiga clicando em Avançar. Agora clique em Capturar sobreposição"como uma ação e, em seguida, pressione Executar, seguido de OK para gerar uma imagem com núcleos rastreados.Salve a imagem clicando sequencialmente em Arquivo, Salvar como e escolhendo TIFF. Para importar o arquivo CSV do TrackMate para a planilha fornecida, clique na guia Dados. No grupo Obter dados de transformação, clique em Do texto/CSV e clique em Importar.Copie a coluna Spot IDB, Track IDC, Frame I e Canal 1M de intensidade média e cole nas colunas A a D da planilha fornecida. Classifique os resultados em ordem alfabética primeiro por ID da trilha, núcleo individual, da célula B5 e, em seguida, por quadro, ponto de tempo, da célula C5. Agora abra o GraphPad Prism, crie uma nova planilha e copie e cole a coluna de tempo da planilha. Em seguida, cole os valores obtidos como intensidade nuclear relativa na tabela GraphPad Prism.Para gerar o gráfico de intensidade nuclear relativa, navegue até a seção Gráfico e selecione XY como a família de gráficos. Em seguida, escolha Pontos e linha de conexão com barras de erro"como o tipo de gráfico. Nas configurações de plotagem, escolha Média e erro" e SEM, e clique em OK. Em seguida, para obter a taxa de exportação, clique em Nova Tabela de Dados e insira os tempos em decimais apenas para as fases estável e de iluminação.Cole os valores obtidos como intensidade nuclear relativa para essas fases na tabela. Na seção Resultados, clique em Análise XY seguida de Exponencial. Em seguida, escolha Regressão não linear e clique em OK. Selecione Platô seguido por um decaimento de fase" como o modelo sob os parâmetros.Em seguida, escolha uma constante igual a 2,25 como X0, uma constante igual a um como Y0 e uma constante igual a zero para o platô. Indique que K deve ser maior que zero e pressione OK. Crie uma nova tabela e cole e transponha os valores K obtidos. Na seção Gráfico, selecione Coluna como a família de grafos e escolha o gráfico de violino como o tipo de gráfico.Selecione Mostrar todos os pontos"como o gráfico e clique em OK. A exportação nuclear com a sonda optogenética lexy foi visualizada em imagens de células vivas. Na condição de controle com células tratadas com metanol, a intensidade nuclear de mCherry diminuiu drasticamente após a iluminação da luz azul, seguida por uma recuperação gradual durante a fase de pós-iluminação. O tratamento com o inibidor de exportação, leptomicina B, causou uma mudança na exportação nuclear, pois o sinal da sonda permaneceu consistentemente nuclear em todos os pontos de tempo.A análise quantitativa da intensidade nuclear relativa mostrou ao longo do tempo uma diminuição lenta até atingir um platô no final da fase de iluminação. As concentrações intermediárias de leptomicina B devem apresentar uma leve exportação nuclear. As taxas de exportação calculadas a partir dos dados de intensidade confirmaram uma taxa de exportação significativamente maior em células tratadas com metanol, uma taxa muito menor com leptomicina B de 0,5 nanomolar e quase nenhuma exportação em uma leptomicina B nanomolar.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Microscopia única molécula approch forneceu introspecções romance em transporte nuclear.

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Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal

Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

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