Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

Nosso laboratório estuda a interação entre os poros nucleares e a organização da cromatina. Portanto, estudamos como os poros nucleares afetam a organização da cromatina, mas também inversamente se a organização da cromatina afeta a função dos poros nucleares, especialmente no transporte nucleocitoplasmático. O transporte nucleocitoplasmático é um processo muito rápido, portanto, um desafio é detectar mudanças na dinâmica do transporte nucleocitoplasmático em células vivas.

Não há muitas ferramentas disponíveis para monitorar o transporte nucleocitoplasmático em células vivas. Ao implementar uma técnica semiautomatizada e aprimorada, esperamos facilitar o uso dessas ferramentas. Nosso protocolo é baseado em aprendizado profundo.

Limita o erro e reduz muito o tempo necessário para a análise. O que antes levaria um dia agora leva apenas uma ou duas horas. Para começar, inicie o software FIJI no sistema do computador.

Selecione a fase estável como imagem um, a fase de iluminação como imagem dois e a fase de recuperação como imagem três. Concatene as três imagens que representam três fases para produzir uma única imagem. Salve a imagem mesclada obtida para segmentação navegando até Arquivo e selecionando Salvar como TIFF.

Em seguida, divida o canal mCherry selecionando Imagem, Cor e Dividir canais. Em seguida, salve a imagem dividida acessando Arquivo, Salvar como e TIFF. Para verificar se há branqueamento durante a aquisição, selecione sequencialmente Imagem, Pilhas e Plotar perfil do eixo Z.

Em seguida, clique em Dados, seguido de Copiar primeiro conjunto de dados e cole-o na planilha fornecida na célula de perfil do eixo Z. Agora desenhe uma região circular de interesse, aproximando o tamanho médio de um núcleo, clicando em Analisar, seguido de Ferramentas e clicando em ROI Manager. Adicione o ROI e salve-o navegando até Mais e clicando em Salvar.

Coloque o ROI salvo em uma região livre de células durante o lapso de tempo. Certifique-se de que o valor médio de cinza" esteja selecionado em Analisar e definir medições. Em seguida, clique em Mais, Multi Measure.

Marque Medir todas as 50 fatias"e Um ROI por fatia"e clique em OK para registrar a intensidade. Copie e cole todos os valores de intensidade medidos na planilha fornecida na célula de fundo do ROI. Em seguida, feche a imagem apenas com o canal mCherry e selecione a imagem salva com canais mesclados.

Agora abra o plug-in TrackMate clicando sequencialmente em Plugins, Tracking e TrackMate. Confirme se os pontos de tempo variam de zero a 49 e clique em Avançar. Selecione o detector StarDist e clique em Avançar.

Escolha o canal dois, SiR-DNA, para segmentação de núcleos e aguarde a conclusão do processo. Deixe os parâmetros padrão na janela de limite e clique em Avançar. Crie filtros usando Intensidade média, Canal Um, para excluir núcleos com valores extremos de sinal.

Crie um filtro para selecionar valores acima do limite definido e outro para selecionar os valores abaixo do limite. Da mesma forma, adicione dois filtros de área para remover detritos ou células mortas e clique em Avançar. Escolha o rastreador LAP simples e clique em Avançar.

Em seguida, ajuste os parâmetros de rastreamento. Defina a distância máxima de vinculação "para 30 micrômetros, a distância máxima de fechamento de lacuna" para 15 micrômetros e a folga máxima do quadro de fechamento de lacuna" para três. Em seguida, clique em Avançar.

Após os cálculos, clique em Avançar para definir filtros nas trilhas. Para selecionar apenas os núcleos que foram rastreados durante todo o curso de tempo, escolha o maior número de pontos no rastreamento e clique em Avançar. Em seguida, marque Exibir nomes de pontos "para refazer cada núcleo em análises posteriores e personalizar outros recursos de exibição conforme preferir.

Na parte inferior da página, clique em Trilhas e escolha Exportar para CSV"para salvar a tabela de medição. Feche a tabela e prossiga clicando em Avançar. Agora clique em Capturar sobreposição"como uma ação e, em seguida, pressione Executar, seguido de OK para gerar uma imagem com núcleos rastreados.

Salve a imagem clicando sequencialmente em Arquivo, Salvar como e escolhendo TIFF. Para importar o arquivo CSV do TrackMate para a planilha fornecida, clique na guia Dados. No grupo Obter dados de transformação, clique em Do texto/CSV e clique em Importar.

Copie a coluna Spot IDB, Track IDC, Frame I e Canal 1M de intensidade média e cole nas colunas A a D da planilha fornecida. Classifique os resultados em ordem alfabética primeiro por ID da trilha, núcleo individual, da célula B5 e, em seguida, por quadro, ponto de tempo, da célula C5. Agora abra o GraphPad Prism, crie uma nova planilha e copie e cole a coluna de tempo da planilha. Em seguida, cole os valores obtidos como intensidade nuclear relativa na tabela GraphPad Prism.

Para gerar o gráfico de intensidade nuclear relativa, navegue até a seção Gráfico e selecione XY como a família de gráficos. Em seguida, escolha Pontos e linha de conexão com barras de erro"como o tipo de gráfico. Nas configurações de plotagem, escolha Média e erro" e SEM, e clique em OK. Em seguida, para obter a taxa de exportação, clique em Nova Tabela de Dados e insira os tempos em decimais apenas para as fases estável e de iluminação.

Cole os valores obtidos como intensidade nuclear relativa para essas fases na tabela. Na seção Resultados, clique em Análise XY seguida de Exponencial. Em seguida, escolha Regressão não linear e clique em OK. Selecione Platô seguido por um decaimento de fase" como o modelo sob os parâmetros.

Em seguida, escolha uma constante igual a 2,25 como X0, uma constante igual a um como Y0 e uma constante igual a zero para o platô. Indique que K deve ser maior que zero e pressione OK. Crie uma nova tabela e cole e transponha os valores K obtidos. Na seção Gráfico, selecione Coluna como a família de grafos e escolha o gráfico de violino como o tipo de gráfico.

Selecione Mostrar todos os pontos"como o gráfico e clique em OK. A exportação nuclear com a sonda optogenética lexy foi visualizada em imagens de células vivas. Na condição de controle com células tratadas com metanol, a intensidade nuclear de mCherry diminuiu drasticamente após a iluminação da luz azul, seguida por uma recuperação gradual durante a fase de pós-iluminação. O tratamento com o inibidor de exportação, leptomicina B, causou uma mudança na exportação nuclear, pois o sinal da sonda permaneceu consistentemente nuclear em todos os pontos de tempo.

A análise quantitativa da intensidade nuclear relativa mostrou ao longo do tempo uma diminuição lenta até atingir um platô no final da fase de iluminação. As concentrações intermediárias de leptomicina B devem apresentar uma leve exportação nuclear. As taxas de exportação calculadas a partir dos dados de intensidade confirmaram uma taxa de exportação significativamente maior em células tratadas com metanol, uma taxa muito menor com leptomicina B de 0,5 nanomolar e quase nenhuma exportação em uma leptomicina B nanomolar.