Name: Um sistema de co-cultura modificado para entender as interações entre células granulosa-teca no ovário bovino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda um sistema de co-cultura modificado para estudar interações entre células da teca e granulosa em ovários bovinos. Este modelo replica o ambiente in vivo para análise de sinalização parácrina e dinâmica folicular.

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<ol><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Forde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrous+cycles+in+Bos+taurus+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrous cycles in Bos taurus cattle.</a> Anim Reprod Sci. 124 (3-4), 163-169 (2011).</li>
<li>Hennet, M. L., Combelles, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antral+follicle%3A+A+microenvironment+for+oocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The antral follicle: A microenvironment for oocyte differentiation.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 819-831 (2012).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+Preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Research resource: Preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Mol Endocrinol. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell Tissue Res. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+culture+model+of+estrogen-producing+primary+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells.</a> J Vis Exp. (139), e58208(2018).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+Induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biol Reprod. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+increases+cytochrome+P450+aromatase+messenger+ribonucleic+acid+transcripts+in+non-luteinizing+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Androstenedione increases cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid transcripts in non-luteinizing bovine granulosa cells.</a> Mol Reprod Dev. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Chandrasekher, Y. A., Fortune, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxytocin+on+steroidogenesis+by+bovine+theca+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxytocin on steroidogenesis by bovine theca and granulosa cells.</a> Endocrinology. 127 (2), 926-933 (1990).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Gong, J. G., McBride, D., Bramley, T. A., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+bovine+somatotrophin%2C+insulin-like+growth+factor-I+and+insulin+on+bovine+granulosa+cell+steroidogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro.</a> J Endocrinol. 143 (1), 157-164 (1994).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+induces+specific+genome-wide+alterations+of+gene+expression+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">L-lactate induces specific genome-wide alterations of gene expression in cultured bovine granulosa cells.</a> BMC Genomics. 20 (1), 273(2019).</li>
<li>Baddela, V. S., Sharma, A., Plinski, C., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+protects+granulosa+cells+from+oleic+acid+induced+steatosis+and+rescues+progesterone+production+via+cAMP+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid protects granulosa cells from oleic acid induced steatosis and rescues progesterone production via cAMP dependent mechanism.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1867 (8), 159159(2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+free+fatty+acids+affect+bovine+granulosa+cell+function%3A+a+molecular+cue+for+compromised+reproduction+during+negative+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Elevated free fatty acids affect bovine granulosa cell function: a molecular cue for compromised reproduction during negative energy balance.</a> Endocr Connect. 8 (5), 493-505 (2019).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+oestrogen+synthesis+-+The+two-cell%2C+two-+gonadotrophin+model+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Follicular oestrogen synthesis - The two-cell, two- gonadotrophin model revisited.</a> Mol Cell Endocrinol. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Campen, K. A., Lavallee, M., Combelles, C. M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bisphenol+S+on+bovine+granulosa+and+theca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">The impact of bisphenol S on bovine granulosa and theca cells.</a> Reprod Domest Anim. 53 (2), 450-457 (2018).</li>
<li>Glister, C., Richards, S. L., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+%28BMP%29+-4%2C+-6%2C+and+-7+potently+suppress+basal+and+luteinizing+hormone-induced+androgen+production+by+bovine+theca+interna+cells+in+primary+culture%3A+could+ovarian+hyperandrogenic+dysfunction+be+caused+by+a+defect+in+thecal+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins (BMP) -4, -6, and -7 potently suppress basal and luteinizing hormone-induced androgen production by bovine theca interna cells in primary culture: could ovarian hyperandrogenic dysfunction be caused by a defect in thecal BMP signaling.</a> Endocrinology. 146 (4), 1883-1892 (2005).</li>
<li>Wrathall, J. H., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibin-related+peptides+and+oestradiol+on+androstenedione+and+progesterone+secretion+by+bovine+theca+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibin-related peptides and oestradiol on androstenedione and progesterone secretion by bovine theca cells in vitro.</a> J Endocrinol. 145 (3), 491-500 (1995).</li>
<li>Shores, E. M., Picton, H. M., Hunter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+pig+theca+cell+steroidogenesis+by+LH%2C+insulin-like+growth+factor+I+and+granulosa+cells+in+serum-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH, insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture.</a> J Reprod Fertil. 118 (2), 211-219 (2000).</li>
<li>Gregoraszczuk, E. L., Ptak, A., Karniewska, M., Ropstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+defined+mixtures+of+PCBs%2C+p%2Cp%27-DDT+and+its+metabolite+p%2Cp%27-DDE%2C+on+co-culture+of+porcine+theca+and+granulosa+cells%3A+steroid+secretion%2C+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co-culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis.</a> Reprod Toxicol. 26 (2), 170-174 (2008).</li>
<li>Rak, A., Drwal, E., Wróbel, A., Gregoraszczuk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistin+is+a+survival+factor+for+porcine+ovarian+follicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Resistin is a survival factor for porcine ovarian follicular cells.</a> Reproduction. 150 (4), 343-355 (2015).</li>
<li>Kotsuji, F., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The role of granulosa and theca cell interactions in ovarian structure and function.</a> Microsc Res Tech. 27 (2), 97-107 (1994).</li>
<li>Orisaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+granulosa+cell+differentiation+during+gonadotropin-independent+follicular+growth+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle.</a> Mol Reprod Dev. 73 (6), 737-744 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cell interactions in ovarian follicular maturation.</a> Microsc Res Tech. 69 (6), 450-458 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+apoptosis+and+proliferation+of+granulosa+cells%3A+changes+during+bovine+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation.</a> Biol Reprod. 66 (6), 1635-1639 (2002).</li>
<li>Allegrucci, C., Hunter, M. G., Webb, R., Luck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bovine+granulosa+and+theca+cells+in+a+novel+serum-free+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interaction of bovine granulosa and theca cells in a novel serum-free co-culture system.</a> Reproduction. 126 (4), 527-538 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+by+side+comparison+between+dynamic+versus+static+models+of+blood-brain+barrier+in+vitro%3A+A+permeability+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: A permeability study.</a> Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolated+Brain+Microvessel%3A+A+Versatile+Experimental+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Isolated Brain Microvessel: A Versatile Experimental Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Front Physiol. 11, 398(2020).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Nimz, M., Spitschak, M., Schneider, F., Fürbass, R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+genes+encoding+steroidogenic+enzymes+and+hormone+receptors+in+late+preovulatory+follicles+of+the+cow+coincides+with+an+accumulation+of+intrafollicular+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of genes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatory follicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicular steroids.</a> Domest Anim Endocrinol. 37, 45-54 (2009).</li>
<li>Amsterdam, A., May, J. V., Schomberg, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+insulin+and+follicle-stimulating+hormone+on+biochemical+and+morphological+differentiation+of+porcine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of insulin and follicle-stimulating hormone on biochemical and morphological differentiation of porcine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 39 (2), 379-390 (1988).</li>
<li>Monga, R., Sharma, I., Datta, T. K., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+serum-free+buffalo+granulosa+cell+culture+and+analysis+of+genes+involved+in+terminal+differentiation+from+FSH-+to+LH-responsive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of serum-free buffalo granulosa cell culture and analysis of genes involved in terminal differentiation from FSH- to LH-responsive phenotype.</a> Domest Anim Endocrinol. 41 (4), 195-206 (2011).</li>
<li>Bao, B., Garverick, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+steroidogenic+enzyme+and+gonadotropin+receptor+genes+in+bovine+follicles+during+ovarian+follicular+waves%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: A review.</a> J Anim Sci. 76 (7), 1903-1921 (1998).</li>
<li>Bao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+messenger+ribonucleic+acid+encoding+luteinizing+hormone+receptor%2C+cytochrome+P450+side+chain+cleavage%2C+and+aromatase+are+associated+with+recruitment+and+selection+of+bovine+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450 side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles.</a> Biol Reprod. 56 (5), 1158-1168 (1997).</li>
<li>Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B. K., Kotsuji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa-theca+cell+interactions+during+preantral+follicular+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ovarian.+Res%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development.</a> J. Ovarian. Res. 2 (1), 9(2009).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
<li>Kotsuji, F., Kamitani, N., Goto, K., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+theca+and+granulosa+cell+interactions+modulate+their+growth%2C+morphology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bovine theca and granulosa cell interactions modulate their growth, morphology, and function.</a> Biol Reprod. 43 (5), 726-732 (1990).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x Hank's Solução Salinal Balanceada HBSS (w Mg/Ca, Vermelho de Fenol)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. L201-10</td><td>dissolver em água ultrapura; ajustar o pH para 7,4 da solução de digestão (HBSS e HEPES) e realizar filtração estéril antes de usar</td></tr><tr><td>Agulha 18 G, 40 mm, diâmetro 1,2 mm</td><td>Roth</td><td>281T.1</td><td>agulha descartável, atalho</td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml (Omnifix Luer)</td><td>Roth</td><td>LY22.1</td><td></td></tr><tr><td>acutase</td><td>Merck</td><td>Rolamento A6964</td><td>filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>anfotericina B (250 &micro; g/ml)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. AB17.01050</td><td></td></tr><tr><td>androstenediona</td><td>Merck</td><td>46033</td><td>utilizamos uma solução reserva de 10 mM, diluída em etanol a 100%; filial da empresa: Supelco</td></tr><tr><td>binóculo Carl Zeiss Technival2</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>não aplicável</td><td>usado em conjunto com a luz incidente Schott KL 1600 LED</td></tr><tr><td>BSA (5%)</td><td>Merck</td><td>Resposta 3311</td><td>filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>filtro de células (100 &micro; tamanho do poro m)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.100</td><td>Encaixe em tubos de centrifugação de 50 ml</td></tr><tr><td>colágeno R (0,2%)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase NB8 (10%)</td><td>Nordmark</td><td>S1745601</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento de células CoolCell LX&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CLS432002</td><td>produto da Corning</td></tr><tr><td>Frascos para injetáveis de criopreservação (2 ml)</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP89020</td><td></td></tr><tr><td>prato de cultura, 12 poços, fundo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92112</td><td></td></tr><tr><td>prato de cultura, 24 poços, fundo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92424</td><td></td></tr><tr><td>prato de cultura, 6 poços, fundo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem Ca2+, Mg2+</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. L182-10</td><td>dissolver em água ultrapura e autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>estradiol, 17b-[2,4,6,7-3H]</td><td>Hartmann Analytik</td><td>ART1555</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal de bezerro (FBS Superior stabil)</td><td>Bio & Vender</td><td>FBS. S0615</td><td></td></tr><tr><td>FSH (~ 7.000 UI / mg; da hipófise humana)</td><td>Merck</td><td>F4021</td><td>preferimos usar uma solução estoque de 2 &micro; g/ml, diluído em NaCl a 0,9 %; filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>inserções de cultura de células suspensas (0,4 &micro; tamanho do poro m)</td><td>cellQART</td><td>9320412</td><td>ao fazer o pedido, esteja ciente das diferentes propriedades das pastilhas; preferimos uma membrana PET transparente para microscopia de contraste de fase</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Roth</td><td>9105.2</td><td>ajustar o pH para 7,4 da solução de digestão (HBSS e HEPES) e realizar filtração estéril antes de usar</td></tr><tr><td>Holo-transferrina (bovinos)</td><td>Merck</td><td>T1283</td><td>dissolver em água estéril; filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Mini Kit de RNA innuPREP 2.0</td><td>IST innuscreen</td><td>845-KS-2040250</td><td></td></tr><tr><td>insulina (10 mg/ml; do pâncreas bovino)</td><td>Merck</td><td>I0516</td><td>dissolver em 1x PBS; filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. K0283</td><td></td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Merck</td><td>I1146</td><td>usamos uma solução estoque de 200 &micro; g/ml, dissolvido em HCl 10 mM e 1x PBS com 1 mg/ml BSA; filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 1000</td><td>ThermoScientific</td><td>não aplicável</td><td>Medição da concentração de RNA</td></tr><tr><td>NEA (100x)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. K0293</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina (10.000 UI/10 mg/ml)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. Resposta A2213</td><td></td></tr><tr><td>água purificada, adequada para cultura de células</td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA SensiFAST</td><td>Biolinha</td><td>BIO-65054</td><td>fornecido através do parceiro de distribuição BioCat</td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio (7,5%)</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. L1713</td><td></td></tr><tr><td>selenito de sódio</td><td>Merck</td><td>S9133</td><td>dissolver em água estéril; filial da empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>termoagitador TS-100C</td><td>Fischer Scientific</td><td>12357627</td><td>usado em conjunto com o bloco HC18 (Cat.-No. 12337627)</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Bio & Vender</td><td>BS. Rolamento F0915</td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema de co-cultura modificado para entender as interações entre células granulosa-teca no ovário bovino

A Modified Co-Culture System for Understanding Granulosa-Theca Cell Interactions in the Bovine Ovary

Embora TCs e GCs tenham sido isolados usando técnicas de separação mecânica bem estabelecidas baseadas na compartimentalização folicular, a expressão de genes específicos do tipo de célula CYP17A1 e CYP19A1 foi avaliada para eliminar o risco de contaminação cruzada. CYP17A1 foi expresso exclusivamente em CTs recém-isolados, enquanto CYP19A1 foi predominantemente expresso em CGs recém-isolados (Figura 2).
O sistema de co-cultura permite a compartimentalização das células da teca e da granulosa bovina em lados opostos de uma inserção de membrana, mimetizando assim a organização espacial in vivo. Após três dias em cultura, os TCs exibiram uma morfologia achatada e alongada à medida que se espalhavam pela superfície da membrana de inserção revestida de colágeno, indicando uma fixação bem-sucedida (Figura 3A). Quando cultivados sozinhos durante todo o período de 9 dias, os TCs continuaram a proliferar e atingiram a confluência no dia 9 (Figura 3B). Em contraste, os GCs cultivados sozinhos por 6 dias na membrana de inserção revestida com colágeno desenvolveram um fenótipo semelhante ao fibroblasto, que é característico dos GCs in vitro ( Figura 3C ). Além disso, como descrito anteriormente, os GCs tendiam a formar clusters, uma característica típica dessas células em cultura 5,7,31,32. No sistema de co-cultura, não foram observadas diferenças morfológicas aparentes em TCs ou GCs quando comparados às suas respectivas monoculturas pareadas no tempo (Figura 3D), indicando que o ambiente baseado em inserção mantém o comportamento celular normal. No entanto, devido a limitações técnicas, a avaliação microscópica da co-cultura permanece desafiadora, particularmente na distinção e avaliação da morfologia do CT independentemente das outras células. Para superar essas limitações, um protocolo otimizado para fixação celular está sendo abordado de acordo com a exploração de estratégias alternativas para identificação celular na ausência de anticorpos específicos para imunocoloração.
A funcionalidade do sistema de co-cultura foi avaliada pela análise da produção hormonal e da expressão de genes-marcadores chave para TCs e GCs33,34, confirmando os papéis esteroidogênicos específicos do tipo de célula. Uma comparação entre o modelo de monocultura de GC e o modelo de cocultura revelou níveis semelhantes de estradiol (E2) produzidos in vitro. No entanto, como esperado, a monocultura de TC produziu apenas quantidades insignificantes de E2, consistente com a hipótese de 2 células-2-gonadotrofinas (Figura 4A) 15, que afirma que as células tecas não têm a capacidade de sintetizar E2 de forma independente.
Para avaliar ainda mais a relevância fisiológica das condições de cultivo, a expressão de genes-marcadores chave33 foi examinada. De acordo com a hipótese de 2 células-2-gonadotrofinas, a CYP19A1 foi predominantemente expressa em GCs, enquanto a CYP17A1 foi detectada principalmente em TCs, um padrão observado em condições de mono e co-cultura (Figura 4B, C). Notavelmente, a abundância de transcritos de CYP19A1 foi maior em GCs dentro do sistema de co-cultura em comparação com a monocultura de GC, apesar de não terem sido observadas diferenças nas concentrações de estradiol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig1.jpg"> 
Figura 1: Representação esquemática da configuração da cultura de células. (A) Um diagrama ilustrando a câmara de inoculação personalizada, que utiliza um tubo truncado no inserto invertido para evitar vazamento de meio durante o período inicial de cultura. (B) Linha do tempo do procedimento experimental: Os TCs foram cultivados no inserto invertido por três dias para permitir a fixação. A inserção foi invertida e os GCs foram semeados no lado oposto, seguidos por mais seis dias de cultura. O estudo comparou TCs e GCs cultivados separadamente ao sistema de co-cultura TC-GC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig2.jpg"> 
Figura 2: Expressão gênica de marcadores específicos do tipo de célula em células da granulosa e teca recém-isoladas. (A) CYP17A1 foi expressa exclusivamente em TCs, enquanto (B) CYP19A1 foi predominantemente detectada em GCs, confirmando a especificidade e pureza inicial das populações de células isoladas antes do cultivo. Os dados são apresentados como expressão relativa normalizada para a média geométrica dos genes de referência RPLP0 e TBP. As médias e o erro padrão das médias são mostrados, os dados foram testados quanto à normalidade e variância, os asteriscos indicam diferenças significativas (n = 3, teste t). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig3.jpg"> 
Figura 3: Morfologia das células da teca e da granulosa em cultura. (A) Os TCs cultivados por 3 dias foram anexados à membrana de inserção revestida com colágeno. (B) Os TCs cresceram até a confluência após todo o período de 9 dias na monocultura. (C) Os GCs exibem o fenótipo típico semelhante a fibroblastos após 6 dias em cultura. (D) A co-cultura de TCs e GCs não mostra diferença morfológica aparente em comparação com as respectivas monoculturas pareadas no tempo. Esta imagem foi tirada após 6 dias de cultura de GC e 9 dias de cultura de TC (no ponto final do experimento de co-cultura). Barras de escala de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig4.jpg"> 
Figura 4: Análise de marcadores funcionais no sistema de co-cultura. (A) As concentrações hormonais de estradiol (E2) confirmam a funcionalidade fisiológica do sistema de cultura celular. (B, C) A análise da expressão gênica do marcador TC CYP17A1 e do marcador GC CYP19A1 demonstra a identidade e o estado funcional de ambas as populações celulares. A média geométrica dos genes de referência RPLP0 e TBP foi utilizada para calcular a expressão relativa. As médias e o erro padrão das médias são mostrados, os dados foram testados quanto à normalidade e variância, os asteriscos indicam diferenças significativas (n = 3, ANOVA de uma via). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um sistema de co-cultura modificado para entender as interações entre células granulosa-teca no ovário bovino

A reliable co-culture of granulosa (GCs) and theca cells (TCs) has the potential to facilitate a more comprehensive understanding of the interactions, ...

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Research

JoVE Journal

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