Microscopia de Expansão: Imagem Fluorescente de Alta Resolução com Microscópio Convencional

Somos biólogos celulares investigando o papel do microtúbulo e sua função associada em diferentes organismos modelo. Nosso objetivo é investigar seu papel na organização celular, morfogênese, ciliogênese e divisão. Nos últimos cinco anos, contribuímos para o entendimento da composição molecular circular, notadamente por meio do uso da microscopia de expansão.

E com isso, revelamos a característica principal de sua montagem e função. Ao combinar microscopia de expansão com criofixação, nosso protocolo possibilita imagens de alta resolução enquanto preserva a estrutura quase nativa do elemento celular, que supera a principal limitação da microscopia de super-resolução. Portanto, a microscopia de expansão é uma técnica de baixo custo e fácil de implementar que dá acesso a todo o laboratório a super resolução.

Para começar, use uma seringa e uma agulha para preencher cada tubo de cinco mililitros com um mililitro extra de acetona seca sob um capuz químico. Coloque os tubos em posição vertical em um suporte de metal e coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Encha metade de uma caixa de poliestireno de 30 por 30 centímetros de espessura com gelo seco e depois encha o dewar tipo Vitrobot com nitrogênio líquido até que a evaporação pare.

Agora, remova a aranha do aparelho de mergulho e encha a câmara metálica de mergulho com etano líquido. Espere 10 minutos para permitir que o etano atinja o equilíbrio. Depois, pegue uma capa de 12 milímetros com pinça fina e passe com um papel de seda para absorver o excesso de meio da capa de cobertura.

Segure a lâmina até a metade, usando pinças com um anel de fixação compatível com o desentupidor criogênico. Coloque a pinça que segura a capa no suporte do desentupidor criogênico e use papel Whatman para remover qualquer meio restante. Ative o desentupidor criogênico para mergulhar o coverslip na solução de etano contida na câmara metálica.

Depois, transfira rapidamente o slip para o tubo que contém acetona congelada. Incube os tubos contendo as coberturas em gelo seco em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Coloque o recipiente fechado em um agitador orbital ajustado entre 50 e 100 RPM e agite durante a noite a quatro graus Celsius para deixar a temperatura subir gradualmente.

Em seguida, remova a maior parte do gelo seco da caixa. Continue a agitação no agitador orbital por mais 45 minutos para deixar a temperatura subir de menos 80 graus Celsius para menos 20 graus Celsius. Abra e feche brevemente cada tubo para liberar a pressão interna.

Depois, transfira cada cobertura para uma placa de 12 poços ou um recipiente adequado pré-preenchido com solução 100% de etanol pré-refrigerada. Após uma incubação de cinco minutos, reidrate as coberturas através de uma série graduada de etanol. Após transferir os slips para o PBS, coloque-os sob um microscópio.

Use pinças finas para arranhar suavemente a superfície e orientar todas as coberturas com o lado correto voltado para cima. Coloque os revestimentos em uma placa de quatro poços preenchida com 0,5 a um mililitro de solução de 2%acrilamida e 1,4% de formaldeído em PBS. Em seguida, incube as coberturas nesta solução a 37 graus Celsius sem agitação.

Em seguida, descongele 10% de APS e a solução gelificante no gelo por 10 minutos antes da gelificação. Prepare uma câmara úmida usando uma fina camada de tecido úmido e Parafilm. Depois guarde a quatro graus Celsius.

Após 10 minutos, coloque a câmara úmida sobre um bloco frio para uso durante a gelificação. Agora, remova as coberturas da solução de ancoragem proteica e retire o excesso de líquido usando papel de seda em duas passagens sucessivas. Adicione APS à solução de gelificação para atingir uma concentração final de 0,5% e o vórtice por dois a três segundos.

Em seguida, pipete duas gotas de 35 microlitros sobre o Parafilm na câmara úmida e coloque delicadamente cada cobertura sobre uma gota, com as células voltadas para baixo na solução gelificante. Transfira a câmara úmida para uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Para desnaturação, use uma ferramenta de biópsia com 0,4 centímetro de diâmetro para extrair pedaços de gel e coloque-os em uma placa de seis poços preenchida com um mililitro de tampão de desnaturação.

Agite a placa por 10 a 15 minutos, até que os géis se soltem das tampons de cobertura, e transfira as peças de gel destacadas para tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros preenchidos com um novo tampão de desnaturação. Incube os géis por 90 minutos a 95 graus Celsius. Após a incubação, transfira os géis para água duplamente destilada por 10 minutos para lavagem.

Meça o diâmetro dos géis usando papel milimétrico para avaliar o fator de expansão do gel. Recubra as coberturas limpas com aproximadamente 200 microlitros de solução de polilisina. Incube as coberturas por uma hora em temperatura ambiente, depois lave-as três vezes com água duplamente destilada para remover o excesso de polilisina.

Depois que as coberturas secarem, guarde-as a quatro graus Celsius até o uso adicional. Coloque o gel devidamente orientado, com as células voltadas para cima, sobre papel sem fiapos e deixe secar para eliminar o excesso de água. Por fim, monte os géis secos com as células voltadas para baixo sobre as coberturas revestidas de poli-D-Lisina.

A criofixação preservou a rede mitocondrial nas células RPE1 de forma mais eficaz do que a fixação de PFA, como mostrado pela coloração por éster do NHS e ATP5A, e permitiu a resolução de cristas mitocondriais, que não eram visíveis com a fixação de PFA. A criofixação resultou em melhor preservação dos microtúbulos dinâmicos, incluindo microtúbulos citoplasmáticos e astrais, em células mitóticas RPE1, em comparação com a fixação de PFA. Trypanosoma brucei, criofixação, preservou melhor a arquitetura da mitocôndria e a estrutura celular geral em comparação com a fixação de PFA, como visualizado com TDH e coloração éster do NHS.

Além disso, a criofixação preservou melhor o retículo endoplasmático do que a fixação de PFA baseada na coloração BIP. Rachaduras foram observadas em células RPE1 criofixadas, mas elas não perturbaram a ultra estrutura de organelos, como mitocôndrias ou microtúbulos. Criofixação deficiente foi indicada por estruturas semelhantes a bolhas e microtúbulos ondulados, acompanhados pela perda da integridade dos organelos membranosos.

A qualidade da expansão dependia da clareza das soluções de acrilato de sódio, com soluções utilizáveis parecendo incolores ou levemente amarelas e translúcidas, enquanto as inutilizáveis aparecendo turvas e laranjas.