Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Bem-vindo ao laboratório da Dra. Hiku Alge Blink. Gostaríamos de agradecer ao Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa pelo financiamento deste projeto. A marcação de células-tronco com agente de contraste fluorescente permite o rastreamento in vivo de células-tronco transplantadas in vivo.

A imagem óptica subsequente das células-tronco marcadas permite estudos longitudinais nos quais é possível monitorar não invasivamente a migração das células in vivo. Este vídeo mostrará como marcar tanto células-tronco embrionárias humanas quanto células-tronco mesenquimais humanas com corantes fluorescentes. Olá, sou Sophie Boddington do Grupo de Pesquisa de Agentes de Contraste do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco.

Hoje gostaria de mostrar a você duas técnicas diferentes para marcação de células-tronco com agentes de contraste fluorescentes. Uma para marcação de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DID, e outra para marcação de células-tronco embrionárias humanas com endign ingra. Então, vamos começar mostrando nossa técnica para marcação de células-tronco mesenquimais humanas com DID.

Para iniciar o procedimento de marcação de células-tronco mesenquimais, precisamos trypsinizar e contá-las para obter uma suspensão com um número definido de células. Como essa é uma técnica padrão de cultura de tecidos, não a mostraremos em detalhes. Desejamos suspender as células que vamos marcar numa densidade de 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura sem soro.

Primeiro, adicionamos cinco microlitros do agente de contraste DID por mililitro de suspensão celular. Em seguida, misturamos a solução por pipetagem suave e incubamos as células com a solução de marcação em uma placa de seis poços com baixa adesão a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a conclusão da simples incubação, devemos transferir a solução celular para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugamos a 400 RCF durante cinco minutos. Em seguida, aspiramos o meio de marcação, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Agora, lavamos as células com PBS.

Pipetamos as células para cima e para baixo, certificando-nos de dissociar o pellet celular. Os dois últimos passos são repetidos mais duas vezes, de modo que tenhamos um total de três etapas de lavagem.

Agora contamos as células e realizamos um teste triplo com azul para determinar a viabilidade celular. Após determinar a viabilidade celular, suas células estão prontas para serem analisadas no imageador óptico. Para iniciar o procedimento de marcação de células-tronco embrionárias humanas, devemos primeiro preparar o agente de contraste conhecido como Verde de Indocianina.

Em seguida, misturamos com o agente de transfeção conhecido como protamina. Para começar, medimos um miligrama do pó de verde de indocianina e dissolvemos em cem microlitros de DMSO. Adicionamos 400 microlitros de DMEM contendo 10%FCS à mistura e agitamos bem, obtendo uma concentração final de dois miligramas por mililitro de verde de indocianina.

Em seguida, adicionamos o agente de transfeção protamina, que atua como um transportador para o agente de contraste, permitindo que ele entre na célula de forma mais eficiente. Agora, misturamos cinco microlitros de sulfato de protamina a 10 miligramas por mililitro com 300 microlitros de ICG e 300 microlitros de DMEM sem soro. Em seguida, agitamos a nova solução de transfeção por cinco minutos para permitir a formação de complexos.

Em seguida, aspiramos o meio antigo e adicionamos 10 mililitros de DMEM PRÉ-AQUECIDO às células. Adicionamos a solução de protamina ICG previamente preparada às células e iniciamos a incubação de uma hora colocando a placa no incubador a 37 graus Celsius. Após a conclusão da incubação, removemos a placa do incubador, aspiramos a solução de marcação e lavamos as células enxaguando a placa com cinco mililitros de PBS.

As células são então trypsinizadas por cinco minutos a 37 graus Celsius. Agitar a placa ajudará a destacar as células em suspensão. Agora pipetamos suavemente para cima e para baixo para dissociar as colônias remanescentes.

Nosso procedimento consiste em neutralizar a tripsina adicionando uma quantidade igual de DMEM contendo 10% de FCS ao recipiente. Em seguida, transferimos a solução celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugamos a solução a 400 RCF durante cinco minutos. Resuspendemos as células em meio completo.

Agora podemos nos livrar dos agregados residuais ou complexos passando as células por uma peneira celular de 40 micrômetros. Uma vez que tenhamos uma solução celular livre de agregados, aspiramos o meio antigo e ressuspendemos o pellet em meio completo para células-tronco embrionárias humanas pré-aquecido. Neste momento, precisamos separar as células de alimentação murinas das células-tronco embrionárias humanas.

Isso é feito para garantir que, posteriormente, estejamos apenas obtendo imagens das células-tronco. Para isso, transferimos a solução celular para uma placa de Petri de 10 centímetros revestida com gelatina. Colocamos a placa no incubador a 37 °C e deixamos repousar por 45 minutos.

Durante este período, certifique-se de não perturbar o recipiente. Agora, as células de suporte aderirão ao recipiente, enquanto as células-tronco não aderirão. Transferimos a solução para fora do recipiente de Petri e, agora, temos uma solução rotulada de células isoladas de células-tronco embrionárias humanas.

Agora podemos contar as células e realizar um teste triplo com azul. Após confirmar a viabilidade, nossas células estão prontas para serem analisadas por imagem. O slide mostra um exemplo de como as células-tronco podem ser visualizadas in vivo em camundongos após terem sido marcadas com agente de contraste fluorescente e administradas por injeção IP.

As varreduras ópticas seriadas mostraram acúmulo inicial das células nos pulmões, seguido por redistribuição no fígado, na medula óssea das extremidades e na glândula tireoide. O marcador fluorescente também pode ser usado para a representação direta de células-tronco transplantadas em espécimes de histopatologia com microscopia fluorescente. Acabamos de mostrar como rotular células-tronco com agentes de contraste fluorescentes durante a marcação celular.

É importante lembrar de padronizar cada etapa. Fazemos isso para garantir uma eficiência de marcação e viabilidade celular consistentes, de modo que os resultados de diferentes experimentos possam ser comparados. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com sua marcação celular.