Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Bem-vindo ao laboratório do Dr.Hiku Alge Blink. Gostaríamos de agradecer ao Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia por financiar este projeto. A marcação de células-tronco com agente de contraste fluorescente permite um rastreamento in vivo de células-tronco transplantadas in vivo.

A imagem óptica subsequente das células-tronco marcadas permite estudos longitudinais onde se é capaz de monitorar de forma não invasiva a migração das células in vivo. Este vídeo mostrará como rotular células-tronco embrionárias humanas e células-tronco mesenquimais humanas com corantes fluorescentes. Olá, sou Sophie Boddington, do Grupo de Pesquisa de Agentes de Contraste do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco.

Hoje eu gostaria de mostrar a vocês duas técnicas diferentes para rotular células-tronco com agentes de contraste fluorescentes. Um para rotular células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente, DID, e outro para rotular células-tronco embrionárias humanas com ingra digno. Então, deixe-me começar mostrando nossa técnica para rotular células-tronco mesenquimais humanas com TDI.

Para iniciar o procedimento de marcação de células-tronco mesenquimais, temos que tentar analisá-las e contá-las para obter uma suspensão com um número definido de células. Como esta é uma técnica padrão de cultura de tecidos, não a mostraremos em detalhes. Queremos suspender as células que rotularemos a uma densidade de 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura livre de soro.

Primeiro, adicionamos cinco microlitros de agente de contraste DID por mililitro de suspensão celular. Agora misturamos a solução por células de pipetagem suaves são incubadas com solução de rotulagem em um prato de baixa fixação de seis poços a 37 graus Celsius por 20 minutos. Uma vez concluída a incubação simples, devemos agora transferir a solução celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Nós centrifugamos a 400 RCF por cinco minutos. Em seguida, aspiramos o meio de rotulagem, garantindo não perturbar o pellet. Agora lavamos as células com PBS.

Pipetamos as células para cima e para baixo, certificando-nos de quebrar a paleta de células. As duas últimas etapas. Repetimos mais duas vezes para que tenhamos um total de três etapas de lavagem.

Agora contamos as células e realizamos um teste de trip e blue para determinar a viabilidade celular. Depois de determinar a viabilidade celular, suas células agora estão prontas para serem visualizadas no gerador de imagens ópticas. Para iniciar o procedimento de rotulagem de células-tronco embrionárias humanas, devemos primeiro preparar o agente de contraste conhecido como Verde de Indocianina.

Em seguida, misturamos com o agente de transfecção conhecido como protamina. Para começar, medimos um miligrama do pó verde de indocianina e o dissolvemos em cem microlitros de DMSO. Adicionamos 400 microlitros de DMEM contendo 10%FCS à mistura e agitamos bem, o que nos deixa com uma concentração de dois miligramas por mililitro de indocianina verde.

Em seguida, adicionamos o agente de transfecção protamina, que atua como um transportador para o agente de contraste, permitindo que ele entre na célula com mais eficiência. Agora misturamos cinco microlitros de sulfato de protamina a 10 miligramas por mililitro com 300 microlitros de ICG e 300 microlitros de DMEM livre de soro. Agora agitamos a nova solução transfecto por cinco minutos para permitir a formação de complexos.

Em seguida, aspiramos o meio antigo e adicionamos 10 mililitros de PREWARM DMEM às células. Adicionamos a solução de ICG de protamina previamente preparada às células e iniciamos a incubação de uma hora colocando o prato na incubadora a 37 graus Celsius. Após a conclusão da incubação, retiramos o prato da incubadora, aspiramos a solução de rotulagem e lavamos as células enxaguando o prato com cinco mililitros de PBS.

As células são então tripsinizadas por cinco minutos a 37 graus Celsius. Agitar o prato ajudará a levantar as células em suspensão. Agora pipetamos suavemente para cima e para baixo para quebrar as colônias restantes.

Neutralizamos a tripsina adicionando uma quantidade igual de DMEM contendo 10% FCS ao prato. Em seguida, transferimos a solução celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugamos a solução a 400 RCF por cinco minutos. Ressuspendemos as células em meio completo.

Agora podemos nos livrar de aglomerados ou complexos residuais passando as células por um filtro de células de 40 micrômetros. Uma vez que tenhamos uma solução de células livres de aglomerado, aspiramos a mídia antiga e ressuspendemos o pellet em meio de células-tronco embrionárias humanas completas pré-vermifugadas. Neste ponto, precisamos separar as células alimentadoras de camundongos das células-tronco embrionárias humanas.

Isso é feito para garantir que, mais tarde, estejamos apenas visualizando as células-tronco. Para isso, transferimos a solução celular para uma placa de Petri de 10 centímetros revestida com gelatina. Colocamos o prato na incubadora de 37 graus e deixamos descansar por 45 minutos.

Durante esse tempo, certifique-se de não mexer no prato. Agora os comedouros vão aderir ao prato e as células-tronco não. Transferimos a solução para fora da placa de Petri e agora temos uma solução de célula única rotulada de células-tronco embrionárias humanas.

Agora podemos contar as células e realizar um teste de viagem em azul nelas. Depois de confirmar a viabilidade, nossas células estão prontas para serem fotografadas. O slide mostra um exemplo de como as células-tronco podem ser visualizadas in vivo em camundongos depois de terem sido marcadas com agente de contraste fluorescente e administradas por meio de uma injeção IP.

Exames de imagem óptica seriados mostraram acúmulo inicial das células nos pulmões, seguido de redistribuição no fígado, medula óssea das extremidades e glândula tireoide. O rótulo fluorescente também pode ser usado para representação direta de células-tronco transplantadas em amostras histopatológicas com microscopia fluorescente. Acabamos de mostrar como rotular células-tronco com agentes de contraste fluorescentes ao realizar a marcação celular.

É importante lembrar de padronizar cada etapa. Fazemos isso para garantir uma eficiência de rotulagem consistente e viabilidade celular, para que os resultados de diferentes experimentos possam ser comparados. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com a rotulagem do seu celular.