Name: Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a rotular células-tronco embrionárias e mesenquimais humanas com corantes fluorescentes para rastreamento in vivo por imagem óptica. Este método permite monitorar a migração celular de forma não invasiva.

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Este projeto foi suportado por uma concessão SEED Leon J. Thal do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia. Tobias Henning foi financiado por uma bolsa de Pesquisa do alemão Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Queremos agradecem Meneses Juanito para o seu conselho sobre a cultura de células estaminais embrionárias humanas.

Rotulagem de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DiD <ol><li> Para iniciar o procedimento para a rotulagem de células-tronco mesenquimais, trypsinize e contar as células para obter uma suspensão com um número definido de células. </li><li> Tome as células fora da incubadora e aspirar a media de idade dos frascos contendo as células a serem rotulados </li><li> Lavar as células com 10 ml de Mg / Ca-free PBS. Aspirar o PBS. O Mg e Ca inibiria o Tripsina, portanto usamos PBS sem eles. </li><li> Adicionar pré-aquecido Tripsina 0,05%, para um frasco T75 usamos 5ml. Assegurar que toda a superfície do frasco é coberto. </li><li> Incubar a 37 ° C na incubadora por aproximadamente 5 minutos. </li><li> Confirme o destacamento sob o microscópio. Se as células continuam a aderir ao balão, toque-o algumas vezes e esperar um pouco mais até que a tripsinização é bem sucedida. </li><li> Agora, é necessário neutralizar a tripsina, adicionando a mídia contendo 10% SFB. Nós usamos uma quantidade igual de mídia como há Tripsina. </li><li> Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para garantir que todas as células são re-suspenso na mídia. </li><li> Transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno estéril 15ml tampado. </li><li> Centrifugar a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante garantindo não perturbar o pellet celular. </li><li> Ressuspender as células em DMEM e prosseguir com a contagem de células. </li><li> Suspender as células a ser rotulados com uma densidade de 1x10 ^ 6 por ml em soro livre de meio de cultura (DMEM). </li><li> Esta foi toda a preparação da suspensão de células. Agora, ele está pronto para iniciar a rotulagem. </li><li> Primeiro, adicione 5 mL de contraste DiD por ml de suspensão celular. </li><li> Em seguida, misturar a solução com cuidado pipetando. </li><li> Incubar as células com a solução de rotulagem a 37 ° C por 20 minutos em um prato bem 6-apego-baixo. </li><li> Uma vez que a incubação simples é completo, é necessário transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno 15 ml tampados. </li><li> Centrífuga para baixo a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Aspirar o meio de rotulagem, garantindo não perturbar pellet celular. </li><li> Lavar as células com PBS. Pipeta as células para cima e para baixo, certificando-se de quebrar o pellet celular. </li><li> Repita os dois últimos passos mais duas vezes, para que haja um total de 3 etapas de lavagem. </li><li> Contar as células e executar um teste de Trypan azul para determinar a viabilidade celular. Estes são protocolos padrão da pilha cultura que não vamos explicar aqui. </li><li> Suas células estão prontas a ser trabalhada no imager óptica. </li></ol> Rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com o ICG corante fluorescente <ol><li> Para iniciar o procedimento para a rotulagem células estaminais embrionárias humanas, prepare o agente de contraste Indocianina Verde. Misturá-lo com o agente de transfecção de protamina. </li><li> Meça 1mg do pó Indocianina Verde. Dissolver o pó ICG em 100 mL de dimetil sulfóxido (DMSO). </li><li> Adicionar 400 mL de Modified Dulbecco Eagles Medium (DMEM + 10% Calf Serum Fetal) meios de comunicação para a mistura e mexa bem. Isso resulta em uma concentração final de 2mg/ml de Indocianina Verde. </li><li> Adicione o Protamina agente de transfecção. Protamina atua como serviço de transporte para o agente de contraste, de modo que fica dentro da célula mais eficiente. </li><li> Mistura de 5 mL de sulfato de protamina, que é fornecido em uma concentração de 10mg/ml, com 300 mL ICG e 300 mL de soro livre Dulbecco Modificado Médio Eagles. </li><li> Agite suavemente a solução de transfecção novo por 5 minutos para permitir complexo a se formar. </li><li> A solução rotulagem está pronto. </li><li> Aspirar a velha mídia a partir CTEh placa de Petri de 10mm. </li><li> Adicionar 5 ml de soro pré-aquecido sem DMEM. </li><li> Adicionar a solução preparada anteriormente Protamina / ICG para as células. Iniciar a incubação de 1 hora de colocar o prato em uma incubadora a 37 ° C. </li><li> Após a incubação estiver completa, remova o prato da incubadora e aspire a solução de rotulagem. </li><li> Lavar as células por lavagem do prato com 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar o PBS e substituir com 5 ml de tripsina 0,25%. Incubar o prato a 37 ° C por 5 minutos para permitir que tripsinização a ocorrer. Ela ajuda a agitar o prato um pouco de vez em quando. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo, para acabar com as colônias restantes. </li><li> Neutralizar a tripsina, adicionando uma quantidade igual de KSR ao prato. </li><li> Transferir a solução de células para um tubo de 15ml e centrifugar a solução a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Ressuspender as células em meios de comunicação completa. </li><li> Se ainda há aglomerações, neste ponto, trypsinize e centrifugar novamente. </li><li> Uma vez que um aglomerado de células sem solução é alcançada, aspirar a velha mídia e ressuspender o sedimento em 10ml de pré-aquecido media total ESC. </li><li> Neste ponto, é necessário separar as células de camundongos a partir do alimentador hESCs. Isto é feito para garantir que, mais tarde, apenas as células-tronco da imagem ocorre. </li><li> Para isso, a transferência ªe solução de célula para um prato de gelatina centímetros revestidas 10. </li><li> Coloque o prato para a 37 ° C incubadora e deixe descansar por 45 minutos. Durante este tempo, certifique-se para não perturbar o prato. Agora, os alimentadores irá aderir ao prato e as células-tronco não. </li><li> Transferir a solução para fora da placa de Petri. e agora temos uma solução rotulados células isoladas de células estaminais embrionárias humanas. </li><li> As células podem agora ser contada e um teste de Trypan azul pode ser realizada sobre eles. </li><li> As células estão prontos para ser fotografada! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI é uma relativamente nova técnica de imageamento, com base na detecção de fluorescência. OI é tão sensível quanto técnicas de radiofármaco baseado em imagem, mas não associados com a exposição a irradiação. OI fornece um meio eficaz de rastreamento de células não-invasiva e repetidamente, assim, fornecendo informações sobre a migração celular para o site de destino. Uma grande limitação da técnica é a penetração nos tecidos limitado de sondas fluorescentes in vivo. Assim, um acúmulo de marcador nos tecidos profundos, mais do que cerca de ...

<table><tbody><tr><td>Verde de Indocianina (IR-125)</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM de Alta Concentração de Glicose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Diluir para concentração final de 0,1% em PBS</td></tr><tr><td>PBS, sem Mg e Ca</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Células Fetais, caracterizado</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Celular (40 &amp;mu;m de Nylon)</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reagente</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de Soro Knockout</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina 200 mM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Protamina</td><td>Reagente</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Óptico de imagem (OI) é uma ferramenta fácil, rápida e barata para a monitorização in vivo de terapias à base de células-tronco novo. A técnica é baseada na rotulagem ex vivo de células-tronco com um corante fluorescente, injeção intravenosa subsequente das células rotuladas e visualização de sua acumulação em órgãos-alvo específicos ou patologias. A técnica apresentada demonstra como nós rotulamos células-tronco mesenquimais (hMSC) por incubação simples com o corante lipofílico fluorescente DiD (C67H103CIN2O3S) e como nós rotulamos células-tronco embrionárias (CTEh) com o FDA aprovou o corante fluorescente indocianina verde (ICG). O mecanismo de absorção é através de adesão e difusão do corante lypophilic através da bicamada fosfolipídica da membrana celular. A eficiência de marcação é normalmente melhorado se as células são incubadas com o corante, isento de soro de mídia em vez de incubação em soro contendo mídia. Além disso, a adição do sulfato de protamina transfecção agente melhora significativamente a absorção de agente de contraste.

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

A imagem óptica (IO) é uma ferramenta simples, rápida e econômica para o monitoramento in vivo de novas terapias baseadas em células-tronco. A técnica baseia-se em ex vivo ...

Bem-vindo ao laboratório da Dra. Hiku Alge Blink. Gostaríamos de agradecer ao Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa pelo financiamento deste projeto. A marcação de células-tronco com agente de contraste fluorescente permite o rastreamento in vivo de células-tronco transplantadas in vivo.A imagem óptica subsequente das células-tronco marcadas permite estudos longitudinais nos quais é possível monitorar não invasivamente a migração das células in vivo. Este vídeo mostrará como marcar tanto células-tronco embrionárias humanas quanto células-tronco mesenquimais humanas com corantes fluorescentes. Olá, sou Sophie Boddington do Grupo de Pesquisa de Agentes de Contraste do Departamento de Radiologia da Universidade da Califórnia em São Francisco.Hoje gostaria de mostrar a você duas técnicas diferentes para marcação de células-tronco com agentes de contraste fluorescentes. Uma para marcação de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DID, e outra para marcação de células-tronco embrionárias humanas com endign ingra. Então, vamos começar mostrando nossa técnica para marcação de células-tronco mesenquimais humanas com DID.Para iniciar o procedimento de marcação de cé

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Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

Neste artigo, descrevemos os princípios para projetar e realizar um experimento de rastreamento de linhagem multicolorido usando camundongos R26R-Confetti. Fornecemos um protocolo específico para rastreamento de células epiteliais da córnea que podem ser modificadas para outros tecidos de interesse.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Combinando transplante de células, marcação do citoesqueleto e abordagens de perda/ganho de função, este protocolo descreve como a placa pré-cordal prospectiva de peixe-zebra migratória pode ser usada para analisar a função de um gene candidato na migração celular in vivo.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Este protocolo descreve estratégias para identificar e enriquecer o estado celular em culturas primárias de células-tronco neurais de camundongos adultos por imagem de autofluorescência usando i) um microscópio confocal, ii) um classificador de células ativadas fluorescentes para realizar imagens de intensidade ou iii) um microscópio multifotônico para realizar imagens de fluorescência ao longo da vida.

Classificação do estado de ativação de células-tronco neurais in vitro usando autofluorescência

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Aprenda a rotular células-tronco embrionárias e mesenquimais humanas com corantes fluorescentes para rastreamento in vivo por imagem óptica. Este método permite monitorar a migração celular de forma não invasiva.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

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