Name: Estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a estabelecer um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos. Este protocolo de bioensaio com folhas destacadas garante alta sobrevivência e desenvolvimento sincronizado das larvas.

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<ol><li>Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Weed+and+pest+control-conventional+and+new+challenges%22">Weed and pest control-conventional and new challenges</a>. , 53-77 (2013).</li>
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<li>Liu, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+selection+of+entomopathogenic+fungi+from+soil+samples+and+evaluation+of+fungal+virulence+against+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests.</a> J Vis Exp. (175), e62882(2021).</li>
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<li>Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+entomopathogenic+fungi+against+chilli+thrips%2C+Scirtothrips+dorsalis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis.</a> J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).</li>
<li>Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lecanicillium+lecanii+%28Zimmermann%29+Zare+%26+Gams+as+an+efficient+biocontrol+agent+of+tea+thrips%2C+Scirtothrips+bispinosus+Bagnall+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Egypt+J+Biol+Pest+Control%22%5BJournal%5D)">Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae).</a> Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).</li>
<li>Panyasiri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+efficacy+of+Purpureocillium+lilacinum+against+chilli+thrips+%28Scirtothrips+dorsalis%29+on+chili+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant.</a> Insects. 13 (8), 684(2022).</li>
<li>Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Amblyseius+swirskii+%28predatory+mite%29+and+Orius+laevigatus+as+biological+control+agents+of+chilli+thrips+%28Scirtothrips+dorsalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ceylon+J+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis).</a> Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pupation+environment+on+pupal+development+and+eclosion+of+chilli+thrips+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Entomol%22%5BJournal%5D)">Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae).</a> Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).</li>
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<li>Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+scanning+electron+microscopy+with+DNA+barcoding%3A+a+novel+approach+for+thrips+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Entomol+Zool%22%5BJournal%5D)">Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification.</a> Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).</li>
<li>Silva, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+abundance+of+cotton+thrips+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+across+crop+and+non-crop+vegetation+in+an+Australian+cotton-producing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Agric+Ecosyst+Environ%22%5BJournal%5D)">Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region.</a> Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).</li>
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<li>Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+entomopathogenic+fungi+and+delivery+methods+for+management+of+thrips+in+chillies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Veg+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies.</a> Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).</li>
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<li>Yang, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+carbon+metabolism-related+glyoxylate+cycle+and+toxin+production+in+Beauveria+bassiana+JEF-007+during+infection+of+bean+bug%2C+Riptortus+pedestris+%28Hemiptera%3A+Alydidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae).</a> Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).</li>
<li>Qayyum, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Entomopathogenic+Fungi%3A+Prospects+and+Challenges%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi: prospects and challenges.</a> Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#00 alfinete de inseto</td><td>Entosphinx&nbsp;</td><td>DMM0220</td><td>Feito no Reino Unido</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Corning incorporada</td><td>MCT-175-C</td><td>Feito nos EUA</td></tr><tr><td>10 &mu; L Alça de inoculação</td><td>NEST Científico</td><td>718201</td><td>Feito nos EUA</td></tr><tr><td>Escada de DNA III de 100 pb</td><td>Geneaid</td><td>DL007</td><td>Feito em Taiwan.</td></tr><tr><td>2x SuperRed PCR Master Mix</td><td>Ferramentas biológicas</td><td>TE-SR01</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>Alpha Plus Científico</td><td>16021</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Bioman Científico</td><td>AGR001.1</td><td>Grau de microbiologia</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Bioman Científico</td><td>Rolamento PB1200</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Tampão de gel de DNA seguro BioGreen</td><td>Bioman Científico</td><td>SDB001T</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Kit de tecido de extração de alta velocidade Easy DNA</td><td>Fisher Biotec</td><td>ET-100</td><td>https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Fabricado na Austrália)</td></tr><tr><td>Primário dianteiro: LCO 1490</td><td>Genômica&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Sequência: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'</td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit</td><td>Geneaid</td><td>DFH300</td><td>http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf</td></tr><tr><td>recipiente de criação de vidro&nbsp;</td><td>Empresa de equipamentos de laboratório Sunshine</td><td></td><td>Tamanho: 35 mm de altura, 45 mm de diâmetro interno. Pode ser repalce por qualquer tamanho simular de plástico ou copo de vidro.</td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Paulo Marienfeld</td><td>640030</td><td>Fabricado na Alemanha</td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Ponto alto</td><td>F740</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>cortador de couro</td><td>Oficina artesanal real</td><td></td><td><a href="https://shopee.tw/jj891004?categoryId=100636&amp; entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406">https://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406</a></td></tr><tr><td>Termociclador MiniAmp</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Rolamento A37834</td><td>Feito nos EUA</td></tr><tr><td>microscópio óptico&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>&nbsp; Ci-L</td><td>Feito no Japão</td></tr><tr><td>pincel de pintura</td><td>Tian Cheng empresa de escovas</td><td>4716608400352</td><td>Pode ser substituído por pincel de aquarela de ponta fina, equivalente a um pincel redondo tamanho 0 ou 1.</td></tr><tr><td>toalha de papel</td><td>Pode Flor</td><td>BLS007-8</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Parafilme M</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Feito nos EUA</td></tr><tr><td>pilão de pellets</td><td>Bioman Científico</td><td>GT100R</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Primer reverso: HCO 2198</td><td>Genômica&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Sequência: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'</td></tr><tr><td>Caldo Sabouraud Dextrose</td><td>HiMedia</td><td>MH033-500G</td><td>Feito na Índia</td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td>Soptop</td><td>SZN71</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Tampão TAE 50X</td><td>Bioman Científico</td><td>TAE501000</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>Pré-adolescente 80</td><td>PanReac AppliChem</td><td>142050.1661</td><td>Feito em Taiwan</td></tr><tr><td>saco com zíper</td><td>empresa plástica de wenchen</td><td>1809000061</td><td>Tamanho: 12 cm de largura e 17 centímetros de comprimento. (Fabricado em Taiwan)</td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (scirtothrips dorsalis hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos

Establishment of a Chilli Thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) Rearing System for Virulence Screening of Entomopathogenic Fungi

O fluxograma experimental apresentado neste estudo demonstrou que o sistema de criação estável dos tripes da pimenta pode ser estabelecido, desde a coleta em campo até a triagem da virulência dos isolados de EPF (Figura 1). Embora a observação morfológica possa distinguir tripes de pimenta de outros tripes de flores, o uso da sequência COI parcial como marcador molecular, incluindo tamanho do amplicon de PCR e sequenciamento de COI, pode confirmar ainda mais ...

Estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos

The chilli thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) is an economically significant pest of ornamental and food crops in Taiwan. Entomopathogenic fungi (EPF) ...

Os tripes da pimenta são uma praga bem estudada em várias culturas. Nossa pesquisa está focada na melhoria do sistema de criação de tripes de pimenta e estender suas aplicações na triagem de fungos entomopatogênicos para experimentos futuros Estudos recentes têm se concentrado na criação em massa de tripes de pimenta em plantas inteiras dentro de gaiolas. Alguns estão explorando alternativas como folhas destacadas, mas os métodos claros e detalhados ainda não estão bem descritos.Este estudo estabeleceu novos métodos de criação em massa de tripes baseados em folhas destacadas, o que pode garantir colônias estáveis de tripes de pimenta. Além disso, um sistema de bioensaio estável e reprodutível foi desenvolvido para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos. Este protocolo aborda a falta de um método padronizado claro para dominar tripes usando disco foliar, com foco em melhorar o gerenciamento do estágio e reduzir o uso de recursos.Este protocolo simplifica o controle do estágio de desenvolvimento, reduz as necessidades de espaço e mão de obra e fornece fornecimento consistente de tripes adequados para bioensaios confiáveis e em larga escala. Nosso laboratório se concentrará na otimização dos métodos de criação em massa e na aplicação deste protocolo a várias espécies de tripes, melhorando as condições ambientais e de manuseio para garantir populações consistentes e saudáveis para bioensaios. Além disso, o sistema de criação em massa pode ser estendido para usar o teste em estufa.Para começar, corte folhas e flores infestadas de tripes de pimenta. Transfira-os para um saco plástico com zíper, certificando-se de selar o saco com um pouco de ar dentro para manter os rasgos vivos. Em seguida, obtenha um recipiente de criação de vidro medindo 35 milímetros de altura e 45 milímetros de diâmetro interno.Coloque três camadas de papel toalha circular, cada uma com 40 milímetros de diâmetro, no fundo do recipiente. Adicione 8 a 10 gotas de água filtrada nas toalhas de papel para manter a umidade. Agora, lave bem uma folha de manga jovem.Examine-o em um microscópio óptico para verificar se há ovos de insetos ou outra contaminação por insetos. Usando um cortador de couro, corte a folha de manga em um disco circular de 40 milímetros de diâmetro e coloque-o sobre a toalha de papel úmida dentro do recipiente de criação de vidro. Observe os tripes da pimenta sob um microscópio óptico com ampliação de 10X.Usando um pincel de pintura fino, transfira 10 tripes adultos, compreendendo cinco machos e cinco fêmeas, para o recipiente de criação de vidro preparado. Em seguida, sele cada recipiente de criação de vidro com duas camadas de Parafilm. Crie aproximadamente 40 pequenos orifícios no Parafilm usando um pino de inseto número 0-0 para garantir a ventilação adequada.Coloque o recipiente de criação de vidro selado em uma incubadora por 48 horas. Observe os tecidos foliares sob um microscópio estéreo para confirmar a presença de ovos indicando a posição dos ovos. Em seguida, coloque um disco de folha de manga fresca na folha com os ovos e adicione 8 a 10 gotas de água filtrada na toalha de papel para manter a umidade.Para a manutenção dos tripes, transfira diretamente a folha contendo as larvas do primeiro ínstar para um novo recipiente de criação de vidro. Observe os tripes da pimenta diariamente. Para a criação em massa dos tripes da pimenta, primeiro colete tripes adultos fêmeas da população mantida.Transfira 10 tripes fêmeas adultas para um recipiente de criação preparado para obter ovos. Em seguida, transfira suavemente aproximadamente 120 larvas de primeiro ínstar para um novo recipiente de criação de vidro usando um pincel fino. Para a identificação molecular, colete um tripes de pimenta adulto em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Homogeneizar os tripes da pimenta usando um pilão de pellets. Em seguida, isole o DNA genômico usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante e amplie usando PCR Master Mix. Verifique o amplicon de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1% para verificar o resultado da amplificação.Extirpar a faixa-alvo de aproximadamente 658 pares de bases do gel. Realize uma pesquisa de explosão no banco de dados do NCBI usando parâmetros padrão para confirmar a identidade da espécie. Para a preparação de fungos entomopatogênicos, adicione dois a três mililitros de 0,03% Tween 80 à superfície de uma cultura fúngica de 10 a 14 dias cultivada em ágar dextrose de Sabouraud com 1/4 de força.Raspe suavemente os conídios usando uma alça estéril. Transfira a suspensão fúngica para um tubo de centrífuga limpo de 15 mililitros. Em seguida, homogeneizar a suspensão por vórtice na velocidade máxima.Filtrar a suspensão com papel de filtro para remover os detritos de hyfil e obter uma suspensão de conídios puros. Use um hemocitômetro para verificar o número de conídios sob um microscópio óptico. Diluir a suspensão para atingir uma concentração de 10 elevado a 8 conídios por mililitro.Em seguida, transfira a suspensão de conídios para um micropulverizador esterilizado com luz ultravioleta para posterior aplicação do bioensaio. Colete e lave as folhas jovens de mirtilo de uma fazenda de mirtilo. Depois de secá-los ao ar, examine sua superfície sob um microscópio estéreo para verificar se há artrópodes ou ovos restantes e remova-os, se houver.Agora, corte um disco de folha de 2,8 centímetros de diâmetro usando um cortador de couro. Em seguida, desinfete o disco foliar em uma solução de hipoclorito de sódio a 1%. E três enxágue-o duas vezes com água esterilizada para remover qualquer resíduo de alvejante.Em seguida, despeje três mililitros de ágar 2,5% de água em pequenos recipientes de vidro dentro de uma coifa de fluxo laminar. Em seguida, transfira suavemente o lado adaxial do disco foliar para cima no ágar e incorpore-o levemente para que apenas uma pequena porção permaneça exposta acima da superfície. Assim que o ágar-ágar solidificar completamente, considere os recipientes de vidro prontos para o bioensaio.Antes da aplicação, bata bem a suspensão de conídios. Usando um micro pulverizador uniformemente, aplique 0,1 mililitro da suspensão na superfície de cada disco de folha a uma distância de aproximadamente 10 centímetros dentro do recipiente de vidro. Agora use um pincel fino para transferir larvas de 10 segundos de ínstar para cada recipiente de vidro.Sele cada recipiente com duas camadas de Parafilm. Crie aproximadamente 30 pequenos orifícios para ventilação no Parafilm usando um pino de inseto número 0-0. Em seguida, coloque os recipientes em uma incubadora por sete dias.Observe e registre a mortalidade de tripes da pimenta sob um microscópio estéreo com aumento de 10X diariamente durante sete dias. Mantenha as larvas mortas dentro do recipiente de vidro para observação de micose para confirmar a infecção fúngica endo patogênica. Para o bioensaio de fungos entomopatogênicos selecionados, preparar três concentrações de suspensões de conídios.Inocular as suspensões em diferentes recipientes de criação. Transforme os dados de mortalidade de cada cepa fúngica usando uma transformação de arco seno antes de realizar ANOVA unidirecional para determinar diferenças significativas entre os tratamentos. Em seguida, calcule os valores medianos de tempo letal e concentração letal mediana usando análise de regressão de inventário.As características morfológicas dos tripes da pimenta em vários estágios da vida foram observadas distintamente, incluindo o estágio larval inicial, o estágio larval posterior e o estágio adulto. A amplificação da reação em cadeia da polimerase direcionada ao gene COI parcial produziu uma banda confirmando a identidade dos tripes coletados em campo como tripes da pimenta. O sistema de criação de folhas destacadas apoiou com sucesso o estabelecimento de colônias de tripes de pimenta com uma taxa de sobrevivência de 90% observada no grupo controle durante o período de observação de sete dias.Dentre os isolados fúngicos entomopatogênicos testados, Cordyceps cateniannulata NCHU-213 causou a maior mortalidade em larvas de tripes de pimenta aos sete dias pós-inoculação, seguido por Cordyceps cateniannulata NCHU-298, enquanto Beauveria bassiana apresentou menor virulência. O valor de LT50 de 10 elevado a 8 conídios por mililitro de Cordyceps cateniannulata NCHU-213 e Cordyceps cateniannulata NCHU-298 apresentou valores semelhantes e exibiu dias mais curtos do que Beauveria bassiana. A micose foi visivelmente observada em cadáveres de tripes infectados com isolados de Cordyceps, como visto na protuberância fúngica que cobre seus corpos.Um aumento dose-dependente na mortalidade foi evidente em tripes tratados com Cordyceps cateniannulata NCHU-213 quatro e cinco dias após a inoculação, enquanto a maior mortalidade de 71,4% foi observada em 10 elevado a 7 conídios por mililitro após sete dias, seguido por 58,9% em 10 elevado a 8 conídios por mililitro e 44,4% em 10 elevado a 6 conídios por mililitro.

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Estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos

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