Microscopia de localização por ultrassom para mapeamento de super-resolução da microvasculatura cerebral de roedores

Nossa pesquisa visa caracterizar a arquitetura microvascular e o fluxo do cérebro, ao mesmo tempo em que aprimora métodos de ultrassom de super-resolução. Desenvolvimentos recentes otimizaram o rastreamento de microbolhas e fortaleceram pipelines de processamento para criar protocolos mais estáveis para mapeamento vascular de super-resolução com ULM. Para começar, coloque um mouse anestesiado em uma estrutura estereotáxica com uma bolsa térmica ajustada para 37 graus Celsius.

Usando pressão firme, mas não prejudicial, belisque o dedo ou a cauda para verificar a ausência de reflexos e confirmar a profundidade adequada da anestesia. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar ulceração ocular e formação de catarata durante o procedimento. Agora, raspe a cabeça do rato usando um aparador.

Aplique creme depilatório. Deixe agir por no máximo de um a 1,5 minutos, depois enxágue bem com água morna e seque com gaze. Em seguida, aplique gel de ultrassom centrífugo na cabeça para garantir o acoplamento acústico.

Para cateterização da veia caudal, use um conjunto de infusão alado de meia polegada calibre 27 conectado a uma agulha de meia polegada calibre 18 com oito polegadas de tubo. Encurte o tubo, se possível, para minimizar o volume morto. Gire suavemente a cauda do animal 90 graus para expor as veias laterais da cauda.

Depois, fixe a cauda no lugar com fita adesiva para manter a estabilidade e evitar movimentos durante a cateterização. Agora, identifique a veia caudal. Para melhorar a visibilidade das veias, aqueça a cauda com água morna para promover a vasodilatação.

Usando um dedo, aplique uma pressão suave na base da cauda e deslize em direção ao local da injeção em direção ao fluxo sanguíneo. Insira a agulha paralela à veia com o bisel voltado para cima. Observe o tubo para ver com um retorno sanguíneo para confirmar a posição correta da agulha.

No sistema de imagem, lance o software funcional de aquisição de ultrassom e crie uma nova sessão experimental. Ajuste a posição da sonda de ultrassom. Agora, inicie a aquisição da visualização ao vivo no software e ajuste a sonda em tempo real usando imagens Power Doppler para centralizar o cérebro na tela.

Otimize os parâmetros de imagem, como contraste e compressão, para melhorar a qualidade da visualização. Depois, abra o menu Angio 3D no software de aquisição. Ajuste os parâmetros de varredura para cobrir totalmente o cérebro, então inicie a aquisição do escaneamento.

Mantenha o software de aquisição aberto e, quando o Angio 3D estiver pronto, lance o software IcoStudio para análise e visualização. Carregue o escaneamento 3D do Angio para análise. Navegue até o painel de registro cerebral e registre o escaneamento 3D Angio usando o modo totalmente automático ou manual.

Salve o registro completo como um arquivo BPS. Agora, abra o menu de navegação do Cérebro e role para baixo até o painel gerenciador do Atlas. Use o navegador de árvores pai e filho para navegar pelo atlas cerebral do Allen Mouse e selecione as regiões anatômicas desejadas para sobreposição no painel de três vistas.

Escolha um plano de imagem que se sobreponha às regiões selecionadas de interesse. Na visão coronal, coloque manualmente dois marcadores para definir a fatia de imagem desejada. Depois, clique em Posicionamento BPS para extrair as coordenadas motoras do plano de imagem selecionado.

Revise a prévia da imagem do escaneamento 3D Angio e clique em Copiar coordenadas BPS. Mude para o software IcoScan e abra o painel Move de sonda. Clique em Neuronavegação, cole os valores copiados e permita que o sistema alinhe automaticamente a sonda com o plano de imagem selecionado.

Depois, inicie a imagem ao vivo para confirmar que o plano de imagem atual está alinhado com o plano previamente selecionado. Usando uma seringa estéril, injete cinco mililitros de solução de cloreto de sódio 0,9% no frasco de microbolhas do agente de contraste de ultrassom através do septo. Agite vigorosamente o frasco por 20 segundos para resuspender as microbolhas e garantir uma dispersão uniforme.

Predefina os parâmetros da gravação, incluindo sequência de ultrassom, taxa de quadros e duração total da gravação. Em seguida, retirar o volume desejado de microbolhas para injeção e iniciar a aquisição. Assim que a aquisição começar, injete 100 microlitros para camundongos usando a diluição apropriada.

Confirme o realce de contraste no painel de visualização ao vivo. Lave imediatamente as microbolhas restantes no volume morto injetando fluido fisiológico no cateter. Espere a aquisição terminar e salve os dados gravados.

Abra o software Icolab e clique na aba Microscopia de localização de ultrassom. Depois, clique em Calcular mapas ULM para iniciar o fluxo de trabalho de processamento. Selecione a pasta de origem que contém os dados previamente adquiridos.

Depois, selecione o arquivo de varredura específico a ser processado e ajuste os limites de tempo de processamento conforme necessário. Clique em Próximo para avançar para a etapa de relatório. Defina o caminho da pasta de saída para salvar os arquivos processados e configure os parâmetros de visualização para as imagens do relatório.

Agora clique em Executar para começar a processar os dados. Uma vez concluído, um arquivo TRK será criado contendo coordenadas localizadas de microbolhas, junto com arquivos TIFF representando densidade, velocidade e amplitude retroespalhada. Carregue o arquivo TRK no IcoStudio para começar a explorar os dados processados.

Depois, use o painel lateral direito no IcoStudio para ajustar parâmetros de visualização, como contraste, compressão e mapa de cores, para melhorar a representação dos dados. Para definir o tempo de integração, ajuste o controle deslizante duplo localizado na parte inferior da vista principal para definir os quadros de início e fim da análise. A aba densidade mostra a distribuição das ocorrências de microbolhas.

Escolha entre densidade absoluta e densidade direcional. Depois disso, clique na aba Velocidade para exibir a velocidade da microbolha em milímetros por segundo usando modos absoluto, direcional, axial e lateral. Ajuste os limiares de contraste, compressão e velocidade para melhorar a clareza da imagem.

Depois, explore a aba Amplitude Retroespalhada para ver a refletividade das microbolhas, que aumenta o contraste e revela estruturas microvasculares e movimento fora do plano. Exporte imagens como PNG de alta resolução ou gere arquivos TIFF para análise quantitativa com tamanho de pixel personalizável. Mapas de densidade de microbolhas de uma fatia cerebral coronal de rato adquirida com ULM resolveram tanto grandes vasos quanto estruturas capilares finas, revelando topologia vascular detalhada, incluindo bifurcações e padrões de ramificação.

O mapa de velocidades da mesma fatia cerebral mostrou fluxo axial direcional claro, com fluxo ascendente representando drenagem venosa, e fluxo descendente correspondente à perfusão arterial, consistente com a arquitetura vascular cortical conhecida. O mapa de amplitude retroespalhada fornecia contraste dependente da profundidade e destacava vasos com base em sua posição elevação, útil para segmentar vasos fora do plano ou de baixa amplitude. Mapas de densidade vascular adquiridos um intervalo fraco no mesmo camundongo mostraram forte sobreposição espacial, confirmando a reprodutibilidade do direcionamento do plano coronal usando o sistema de posicionamento cerebral.

A análise quantitativa do córtex somatossensorial esquerdo entre as sessões mostrou distribuições semelhantes no raio, velocidade e taxa de fluxo do vaso, demonstrando reprodutibilidade na medição. Reprodutibilidade semelhante foi observada na região do tálamo esquerdo, com valores consistentes para raio, velocidade e vazão do vaso entre as sessões da semana um e a semana dois. Este trabalho estabelece que a microscopia de localização por ultrassom pode produzir de forma confiável mapas de super-resolução da estrutura e do fluxo microvascular in vivo.

Esse protocolo supre a necessidade de um procedimento padronizado que permita aquisições robustas de ULM em roedores vivos usando um sistema de ultrassom funcional dedicado.