Limpeza óptica transitória usando moléculas absorventes para imagens ex vivo e in vivo

Esta pesquisa tem como objetivo avaliar e implementar a limpeza de tecidos usando moléculas absorventes como uma estratégia não invasiva para melhorar a imagem biomédica em tecidos ex vivo e animais vivos. Demonstramos que o corante alimentar tartrazina pode ser usado para obter limpeza óptica rápida e reversível em tecidos e animais vivos, aumentando significativamente a profundidade e a clareza da imagem. Nosso protocolo aborda uma lacuna crítica na reprodutibilidade da limpeza óptica transitória observando moléculas e incorpora técnicas avançadas de visualização computacional para melhorar a visibilidade do recurso.

Ao fornecer um protocolo detalhado para limpeza de tecidos com moléculas absorventes, nosso trabalho ajuda a comunidade mais ampla de pesquisa em biologia e imagens biomédicas a aplicar esses métodos em seus próprios estudos. Nosso laboratório vem avançando nessa tecnologia explorando a interação física entre luz e tecido, expandindo a gama de materiais disponíveis e desenvolvendo plataformas de imagem óptica otimizadas. Para começar, calcule a massa necessária de pó de corante de tartrazina para preparar o volume de solução desejado.

Transfira a quantidade calculada de pó de corante para um frasco de vidro limpo. Usando uma pipeta volumétrica, adicione o volume necessário de água deionizada ao frasco para manter a precisão. Se o corante não se dissolver totalmente à temperatura ambiente, coloque o frasco de vidro em um forno de laboratório pré-aquecido a 40 graus Celsius por 10 minutos ou até dissolver completamente.

Em seguida, vórtice a solução de corante por 30 segundos a um minuto para garantir a dissolução completa. Para o tecido ex vivo, corte um tecido de peito de frango na espessura desejada em uma direção paralela às fibras de colágeno e limpe o tecido fatiado suavemente com água. Coloque o tecido entre duas lâminas de microscópio limpas para medir a espessura.

Pressione suavemente as lâminas e use um calibre vernier para medir a distância no centro do tecido. Em seguida, mergulhe o tecido na solução de corante preparada. E coloque o recipiente em um agitador orbital e agite a 100 rotações por minuto por 10 minutos.

Remova o tecido da solução de corante usando uma pinça limpa. Coloque a amostra entre duas lâminas de vidro transparente e capture imagens usando uma câmera digital ou científica configurada para a resolução e ampliação apropriadas. Conduza o processo de imagem em um ambiente de luz controlada para minimizar a interferência de luz externa.

Para medir a transmissão óptica, coloque a amostra preparada em um espectrômetro de infravermelho próximo UV-visível. Certifique-se de que o sistema esteja devidamente revestido e que o feixe de luz passe pela mesma região do tecido antes e depois do tratamento com solução de corante para manter a consistência da medição. Para o procedimento, posicione o animal anestesiado em uma almofada de aquecimento temperada a 37 graus Celsius.

Usando tesouras de pequenos animais, apare o pelo da área de imagem desejada. Aplique o creme depilatório na área aparada por menos de 60 segundos para remover qualquer resíduo de pelos e remova imediatamente o creme. Limpe a pele com lenços umedecidos com álcool para evitar irritações.

Para preparar a configuração da imagem, coloque uma almofada de aquecimento ajustada a 37 graus Celsius abaixo do animal para evitar hipotermia. Alinhe a fonte de luz e a câmera para capturar imagens de alta qualidade. Use uma solução de tartrazina molar de 0,65 misturada com gel de agarose a 0,3% a 0,4% para aplicação.

Usando um conta-gotas, aplique a solução preparada na pele, seja na barriga ou na cabeça, dependendo do experimento. Deixe a solução agir por alguns segundos para iniciar a absorção. Agora, com um cotonete, esfregue suavemente a área de aplicação para distribuir uniformemente a solução e aumentar a absorção dérmica.

Em seguida, massageie a área suavemente com um cotonete limpo e aplique mais solução conforme necessário. Observe o aparecimento de pontos vermelhos alaranjados, que gradualmente se fundirão em uma cor uniforme, indicando penetração bem-sucedida do corante e o início da limpeza óptica. Continue massageando a área até que a pele fique transparente e os órgãos internos fiquem visíveis, o que geralmente leva cerca de três a cinco minutos para uma pequena área.

Coloque suavemente uma lâmina de vidro ou lamínula sobre a pele para reduzir o brilho da superfície e minimizar o reflexo. Limpe suavemente a solução de corante da pele usando um cotonete ou pano macio umedecido com água. O efeito de limpeza óptica será revertido e a pele retornará gradualmente à sua aparência opaca original.

Depois de desligar a anestesia gasosa, permita que o animal recupere a consciência. Quando o animal estiver totalmente acordado e móvel, devolva-o à sua gaiola de origem. No tecido mamário de frango ex vivo não tratado, os padrões subjacentes não eram visíveis e os dados do espectrômetro mostraram baixos valores de transmissão que diminuíram com o aumento da espessura do tecido.

Após o tratamento com uma solução de tartrazina de 0,65 molar, os tecidos tornaram-se visivelmente transparentes e a grade subjacente e os padrões do logotipo emergiram claramente. Aumentos substanciais nos valores de transmissão em todas as espessuras do espectro visível também foram observados. Em camundongos vivos, a aplicação de solução de tartrazina 0,65 molar permitiu a visualização de órgãos internos através da pele minutos após o tratamento, mostrando transparência visivelmente aumentada nas regiões abdominais.

A limpeza óptica do couro cabeludo permitiu a visualização dos vasos sanguíneos cerebrais sem remoção cirúrgica da pele, demonstrando a eficácia da técnica para imagens cerebrais. O efeito de limpeza foi totalmente reversível. Enxaguar o tecido com água restaurou a opacidade e a aparência normal da pele em poucas horas, com o crescimento do cabelo observado ao longo de vários dias.