Técnica de injeção sub-retiniana transescleral minimamente invasiva otimizada em camundongo

As injeções sub-retinianas são uma ferramenta importante para investigações pré-clínicas de terapias para doenças hereditárias da retina. Neste vídeo, apresentamos uma técnica de injeção sub-retiniana otimizada e minimamente invasiva em camundongos. As injeções sub-retinianas transesclerais são uma excelente maneira de fornecer material aos fotorreceptores e RPE.

No entanto, essa técnica é tecnicamente desafiadora e exige o desenvolvimento de um protocolo otimizado para aumentar sua reprodutibilidade e acessibilidade. Nossas melhorias incluem o desenvolvimento de um espéculo palpebral de camundongo, administração pré-operatória de atropina, criação de uma esclerotomia pontual usando uma faca de diamante e otimização do tamanho da agulha e da abordagem de injeção. Esperamos que a consistência, a reprodutibilidade, a excelente cobertura de transdução e o dano cirúrgico mínimo do nosso método melhorem a acessibilidade das injeções sub-retinianas para a comunidade científica.

Nossas otimizações tornam mais fácil e rápido realizar injeções sub-retinianas em camundongos, reduzem a variabilidade experimental e melhoram as taxas de sucesso da injeção. Esta técnica facilitará futuras pesquisas pré-clínicas translacionais de retina. Para começar, administre um miligrama por quilograma de atropina intraperitoneal em um volume total de 50 microlitros 30 minutos antes de realizar a injeção sub-retiniana.

Carregue uma microagulha de vidro com o volume desejado da solução de injeção. Encaixe a agulha no microinjetor e ajuste a pressão de compensação para cinco hectopascais para neutralizar a ação capilar. Coloque o camundongo anestesiado sob um estereomicroscópio de dissecação.

Aplique uma gota de 0,5% de proparacaína no olho para obter anestesia tópica. Aplique uma gota de uma mistura contendo 0,2% de ciclopentolato e 1% de fenilefrina no olho para dilatar a pupila para imagens pós-operatórias da bolha sub-retiniana e reduzir o sangramento intraoperatório. Usando um espéculo de arame em miniatura personalizado, exponha o fórnice superior e imobilize o espéculo para permitir a retração da pálpebra superior com as mãos livres.

Usando uma tesoura Vannas angulada, faça um par de incisão límbica aproximadamente um milímetro posterior ao limbo na conjuntiva superior e na cápsula de Tenon para expor a esclera superior. Remova cuidadosamente quaisquer restos da cápsula de Tenon sobre o local da injeção. Agora segure a borda anterior da peritomia conjuntival e tenotomia com uma pinça dentada travada.

Em seguida, inferoduto suavemente o globo para expor a esclera superior. Aplique imediatamente uma gota de solução salina tamponada balanceada no olho para manter a esclera nua hidratada e obter maior ampliação óptica. Usando uma faca de diamante, faça uma esclerotomia pontual a aproximadamente 12 horas e a um a dois milímetros do limbo.

Posicionar a lâmina tangencialmente à esclera para garantir que a esclerotomia seja pequena e rasa. Use uma esponja cirúrgica para remover suavemente toda a solução salina tamponada balanceada da superfície do olho. Segure o chanfro da agulha em um ângulo raso em relação à esclera e insira lentamente a ponta na esclerotomia, avançando apenas 0,5 a um milímetro para acessar o espaço sub-retiniano sem penetrar na retina.

Enquanto mantém a agulha firme, inicie a injeção a 500 hectopascais usando o pedal e mantenha a pressão contínua por 15 segundos. Remova a agulha e observe um refluxo parcial da solução injetada através do local da esclerotomia, indicando uma entrega bem-sucedida, pois o espaço sub-retiniano não pode acomodar todo o volume da solução injetada. Remova cuidadosamente a pinça de travamento e o espéculo da pálpebra sem aplicar pressão no globo para evitar refluxo adicional.

Imediatamente após a injeção, aplique uma quantidade generosa de pomada lubrificante ocular no olho para ajudar na visualização da bolha sub-retiniana. Uma bolha sub-retiniana foi claramente visível na OCT imediatamente após a injeção transescleral, confirmando o parto bem-sucedido. Para avaliar o epitélio pigmentar da retina, ou RPE, foi injetado o direcionamento da distrofina AAV-8 1-GFP, resultando em fluorescência verde generalizada em toda a camada do epitélio, indicando transdução eficiente e ampla do EPR usando a abordagem transescleral.

AAV-8 rodopsina GFP levou a um forte sinal fluorescente verde em fotorreceptores de bastonetes, visível em seções transversais e vistas de fundo de olho, indicando direcionamento e expressão bem-sucedidos em células fotorreceptoras. AAV8-CAG-mCherry produziu ampla fluorescência vermelha nas camadas da retina, demonstrando a capacidade dessa técnica de suportar a expressão generalizada de transgenes além de tipos específicos de células. O western blotting de lisados retinianos também mostrou forte expressão de proteína fluorescente verde com os níveis mais altos correspondendo ao centro da bolha de injeção, validando a transdução de fotorreceptores com AAV8 rodopsina GFP.

A otimização do título de AAV usando análise de imunofluorescência de seções retinianas permite a seleção do título viral que atinge a transdução de aproximadamente 90% das células-alvo. Por exemplo, neste caso, uma diluição de um a 10 de um estoque viral de rodopsina GFP AAV8 produziu expressão transgênica em quase todos os fotorreceptores. Por outro lado, uma diluição de um a 100 resultou em uma taxa de transdução insuficiente.

O eletrorretinograma mostrou que as injeções transesclerais preservaram a função retiniana normal, enquanto as injeções transretinianas levaram a respostas significativamente reduzidas da onda A e da onda B, indicando danos à retina.