Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

A microscopia multi-harmônica de autofluorescência simultânea sem marcadores, ou microscopia SLAM, captura informações exclusivas em amostras biológicas, medindo interações não lineares com a luz. Em nosso laboratório, usamos essa técnica para estudar a vida e a doença em escala microscópica. Observamos uma mudança em direção à imagem multimodal sem marcadores, oferecendo insights mais ricos sobre as estruturas e dinâmicas celulares e teciduais, evitando toxicidade e permitindo contrastes e correlações complementares entre as modalidades.

Microscópios não lineares de última geração sem rótulos adquirem um sinal de cada vez, arriscando desalinhamento, danos fotográficos e muitos processos simultâneos. O SLAM supera esses problemas permitindo um contraste multimodal estritamente coregistrado, garantindo dados espaciais e temporais confiáveis. Essa técnica permite a excitação e detecção simultâneas de quatro canais em um microscópio multifotônico.

Usando fibra de cristal fotônico para ampliar os pulsos para SHG, THG e fluorescência de dois e três fótons. O SLAM captura informações de sinalização celular estrutural e dinâmica metabólica multiplexada sem artefatos de alinhamento ou rótulos exógenos, permitindo a análise quantitativa padronizada do tecido. Suas aplicações abrangem biologia fundamental, pesquisa translacional e descoberta de biomarcadores em oncologia, neurodegeneração e regeneração de tecidos.

Para começar, use um espectrômetro ou analisador de espectro óptico para medir o laser após o espelho parabólico e verificar a geração supercontínua da fibra de cristal fotônico. Gire a placa intermediária após o divisor de feixe polarizador para otimizar a largura do supercontínuo. Ligue o autocorrelator de microscopia.

No software, defina o detector para o detector interno e ajuste a faixa de varredura para 5 picossegundos para capturar toda a largura da autocorrelação de pulso. Desbloqueie o laser e alinhe o autocorrelacionador ao feixe que sai do modelador de pulso até que um sinal apareça. Certifique-se de que o obturador 2 esteja fechado.

Em seguida, aplique o meio de imersão apropriado, como água ou óleo, na lente objetiva. Coloque o detector externo do autocorrelacionador na platina do microscópio e posicione-o diretamente acima da objetiva. Agora ligue os espelhos do galvanômetro de varredura para definir sua tensão para 0.

Abra o obturador e use um alvo fluorescente para confirmar se o feixe atinge o detector externo. Defina o detector do autocorrelator para ser o detector externo. Em seguida, ajuste a posição do palco até que o sinal apareça.

Ajuste os coeficientes polinomiais do modelador de pulso para minimizar iterativamente a largura de pulso medida pelo autocorrelacionador. À medida que a largura de pulso diminui, reduza a faixa de varredura de acordo para melhorar a precisão e a visualização da função de autocorrelação. Certifique-se de que a entrada do laser para a fibra de cristal fotônico esteja bloqueada e ligue o laser.

Deixe o laser aquecer por 30 minutos. Verifique se o caminho do feixe está livre de obstruções e, em seguida, coloque um medidor de potência óptica no caminho do feixe logo antes da fibra de cristal fotônico. Pressione o botão Control para abrir o obturador 1 e medir a potência de entrada.

Feche o obturador 1 novamente. Mova o medidor de potência para a saída da fibra de cristal fotônico após o espelho parabólico. Abra o obturador 1 e use o estágio de três eixos de entrada para maximizar a potência de saída.

Deixe a fibra de cristal fotônico aquecer por 10 minutos, em seguida, maximize a potência de saída novamente usando o estágio de três eixos e registre a transmissão do PCF. Mova o medidor de potência após o filtro de densidade neutra e gire o filtro para ajustar a potência do laser que atinge a amostra. Multiplique a potência medida pela transmitância da óptica restante para determinar a potência da amostra.

Agora, ligue os galvanômetros e o palco. Inicie o software de aquisição e insira os parâmetros de imagem desejados. Coloque a amostra no palco usando o mesmo meio de imersão que foi aplicado anteriormente à lente objetiva.

Em seguida, desligue as luzes da sala e feche as cortinas para evitar a entrada de luz ambiente. Em seguida, ligue as fontes de alimentação e amplificadores do detector. Feche a caixa de luz ao redor da platina do microscópio.

Use os interruptores de controle eletrônico para abrir manualmente as persianas do detector 3-6. No software de aquisição, pressione a opção Clique para iniciar a aquisição para iniciar a imagem SLAM. Ajuste o foco do microscópio usando o botão do controlador de platina até que a amostra esteja claramente visível.

Use o joystick no controlador de platina do microscópio para encontrar o campo de visão desejado. Uma vez posicionado, clique em Parar e redefinir. Na guia Salvar, alterne Salvar dados para Sim.

Em seguida, pressione a opção Clique para iniciar a aquisição e aguarde a conclusão da imagem. Para manipular a amostra durante a geração de imagens, feche as persianas do detector e use uma lanterna ou farol para iluminação. Após os ajustes, retorne à configuração de imagem.

Para encerrar a aquisição da imagem, feche as persianas do detector, desligue os detectores e só então acenda as luzes da sala. Bloqueie o laser usando o obturador 1 e desligue o laser. Desligue os galvanômetros e stage e feche o software de aquisição.

Descarte a amostra de tecido adequadamente e limpe a estação de trabalho. Uma fibra de cristal fotônico devidamente clivada mostrou uma face plana perpendicular ao seu eixo e uma face limpa. Fibras de cristal fotônico mal clivadas mostraram cortes angulares, faces lascadas e arranhões ou detritos pronunciados na superfície.

O manuseio inadequado ou a contaminação resultaram em acúmulo visível de sujeira e partículas ao redor da superfície da fibra, obscurecendo o padrão do orifício de ar. Um núcleo queimado com regiões escurecidas indicava uma fibra de cristal fotônico danificada no final de sua vida útil. O espectro supercontínuo abrangeu aproximadamente 975-1, 175 nanômetros com um topo plano e modulações espectrais distintas.

A autocorrelação do pulso após a compressão mostrou um perfil simétrico com um meio-máximo estreito de largura total, indicando boa modelagem do pulso. Fontes supercontínuas funcionando adequadamente produziram fortes sinais de segundo e terceiro harmônicos. Um supercontínuo estreito resultou na perda da intensidade do sinal do terceiro harmônico, mantendo o sinal do segundo harmônico.

A ausência de modelagem de pulso reduziu drasticamente todos os sinais não lineares, produzindo uma imagem fraca e de baixo contraste. A imagem SLAM bem-sucedida do tecido renal ex vivo mostrou estruturas distintas de néfrons com vários sinais ópticos fortes, incluindo geração de terceiro harmônico e fluorescência de NADPH. As fibras colágenas intersticiais renais foram identificáveis por meio de fortes sinais de geração de segundo harmônico.

A imagem da razão redox indicou metabolismo mitocondrial aeróbio elevado nos túbulos proximais do córtex renal em comparação com a medula. Um segundo mapa de razão redox confirmou a variação espacial no metabolismo oxidativo e glicolítico, reforçando o uso diferencial de energia dentro do tecido.