Name: Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda microscopia SLAM sem marcação para estudar amostras biológicas com quatro canais simultâneos. Esta técnica avançada permite análise detalhada de tecidos em neurociência e biologia celular.

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A microscopia óptica não linear aproveita a resposta de um espécime à radiação óptica intensa (luz com campos elétricos maiores que 3 × 103 V / cm) para derivar o contraste da imagem, onde a polarização induzida (e, portanto, o sinal gerado) depende não linearmente da intensidade incidente 1,2,3. Como esses múltiplos contrastes são mediados por diferentes interações luz-matéria, a microscopia não linear fornece acesso simultâneo a informações exclusivas sobre a morfologia e a paisagem química de um espécime 1,2,3. Enquanto as técnicas tradicionais de microscopia envolvendo uma interação linear com a luz de iluminação também permitem imagens quantitativas, a microscopia não linear permite uma abordagem mais multimodal, muitas vezes com melhor profundidade de imagem e seccionamento óptico, além de causar menos fotodano à amostra4. No contexto de aplicações biomédicas, como avaliação intraoperatória semelhante à histologia de tecido 5,6, essa técnica permite a sondagem direta de biomoléculas nativas, facilitando investigações contínuas de células vivas sem a necessidade de marcadores ou modificações externas. Essa abordagem evita o uso de tags, rótulos7, moléculas exógenas, proteínas fluorescentes geneticamente expressas ou nanopartículas, que não apenas requerem trabalho extensivo, mas também têm o potencial de interromper a bioquímica nativa do espécime e impactar negativamente as células-alvo ou tecidos 8,9,10. Assim, o microscópio não linear serve como uma ferramenta analítica poderosa e genuína que fornece imagens contínuas de estruturas microscópicas sem alterar a integridade química e estrutural da amostra. Esse recurso abre uma ampla gama de aplicações, desde diagnóstico e descoberta de medicamentos até sinalização celular e biologia de sistemas.
Contrastes multifótons, como autofluorescência de dois fótons (2PAF), autofluorescência de três fótons (3PAF), geração de segundo harmônico (SHG) e geração de terceiro harmônico (THG), conferem vantagens analíticas na caracterização de amostras. A 2PAF é gerada por flavinas endógenas, sendo a flavina adenosina dinucleotídeo (FAD) a mais abundante em sistemas biológicos11. O 3PAF aproveita a excitação do infravermelho próximo para visualizar cromóforos intrínsecos, como NAD(P)H, e permite imagens metabólicas enquanto contorna problemas de fototoxicidade e atenuação relacionados aos raios UV12. O SHG revela especificamente estruturas moleculares não centrossimétricas, como colágeno fibrilar (tipos I, II e III) e matrizes de proteínas 13,14,15,16,17, fornecendo insights estruturais 1. Por fim, o THG, sensível a interfaces e pequenas características estruturais, se destaca na imagem de distribuições lipídicas e vesículas extracelulares 18,19,20,21,22.
Cada um desses sinais de contraste foi explorado independentemente por grupos de pesquisa, estabelecendo o nicho para microscopia não linear multifotônica como uma ferramenta confiável e versátil para aplicações biológicas23 , 24 , 25 , 26 . Esses esforços foram liderados pelos inventores do microscópio 2PAF, que aproveitaram sua tecnologia inovadora para fazer novos insights sobre a morfologia do tecido, o metabolismo celular e até mesmo as características morfofuncionais de patologias como a doença de Alzheimer e o câncer23. Seu trabalho acabou gerando aplicações inovadoras na neurociência27,28. Nos anos seguintes, vários pesquisadores destacaram a sensibilidade do SHG a alterações na matriz extracelular, o andaime que fornece suporte estrutural às células e que sofre alterações substanciais durante a patogênese do câncer29. Notavelmente, Campagnola et al.14,24,30,31 demonstraram que a microscopia de SHG permite a visualização de montagens macromoleculares e supramoleculares, revelando detalhes como o arranjo, concentração e tipo de colágeno que não são detectáveis com técnicas convencionais baseadas em fluorescência. Esses resultados ressaltaram o potencial da microscopia SHG como uma ferramenta de diagnóstico viável em ambientes clínicos. Finalmente, a microscopia THG foi aplicada com sucesso para visualizar as camadas da retina em roedores com resolução subcelular25, mapear estruturas cerebrais32 e capturar a topografia multi-interfacial da invasão de células de melanoma33.
Essas implementações históricas da microscopia não linear geralmente envolviam um laser de femtossegundo (fs) com bloqueio de modo acoplado a uma objetiva de alta abertura numérica (NA) para gerar e coletar os sinais não lineares, que foram então direcionados com um espelho dicróico para um filtro passa-banda e coletados com um tubo fotomultiplicador (PMT) 34 . Apesar de implementações semelhantes, a maioria dos aplicativos se concentrou em adquirir apenas um ou, no máximo, dois contrastes, ignorando os outros. Para realizar plenamente o potencial do microscópio multifotônico, Boppart et al. primeiro implementaram a aquisição sequencial de múltiplos contrastes não lineares21 , 35 , 36 , 37 , seguido por sua detecção simultânea4 , 22 , 38 , 39 , 40 , 41. A técnica resultante, conhecida como microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (SLAM), co-registra espacial e temporalmente os sinais não lineares 2PAF, 3PAF, SHG e THG por meio de excitação de disparo único e detecção multiplex, alcançando assim um poder analítico superior. A co-localização espaço-temporal desses quatro canais fornece dados altamente classificados e ricos em recursos42, oferecendo vantagens sobre os dados adquiridos sequencialmente, eliminando artefatos de movimento e garantindo um registro de imagem aprimorado. Consequentemente, o SLAM permite a geração de características compostas, como taxas ópticas de redução-oxidação, que caracterizam efetivamente as propriedades metabólicas43 , 44 , 45 . Além disso, a análise combinada de sinais entre modalidades facilita a engenharia de recursos adicionais com base na correlação e colocalização de canais. Por exemplo, Shi et al. demonstraram a importância das características de colocalização da microscopia SLAM na classificação precisa das células do ovário de hamster chinês (CHO) usadas na produção farmacêutica42. Desta forma, o SLAM estabelece as bases para o que hoje é considerado o estado da arte em microscopia multifotônica, abrindo caminho para futuros avanços no campo46.
Neste protocolo, descrevemos os principais componentes de um microscópio SLAM (Figura 1) e descrevemos uma metodologia passo a passo para sua implementação. Isso inclui a geração e modelagem dos pulsos de excitação, preparação de amostras de tecido representativas, procedimentos de imagem e processamento, bem como a exibição dos dados resultantes. Ao utilizar tecnologia pronta para uso e técnicas estabelecidas, esse protocolo é universal, transferível e pode ser facilmente reproduzido usando sistemas ópticos semelhantes em diferentes laboratórios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Figura 1: O design óptico de um microscópio multiharmônico de autofluorescência sem rótulo (SLAM) simultâneo. O laser de femtossegundo emite luz de 1040 nm em pulsos de 370 fs a uma taxa de repetição de 10 MHz. A intensidade e a polarização do laser são cuidadosamente controladas antes de bombear um cristal fotônico para gerar um supercontínuo. Os pulsos são então comprimidos por um modelador de pulso e direcionados para um microscópio de varredura a laser personalizado (caixa tracejada). Espelhos dicróicos e filtros passa-banda isolam os sinais não lineares gerados pela amostra antes de serem detectados por detectores de fótons de alta sensibilidade, como tubos fotomultiplicadores (PMTs) ou fotodetectores híbridos (HPDs). O design óptico é baseado em um sistema descrito anteriormente41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Platina de 3 eixos</td><td>ThorLabs</td><td>MAX316</td><td>Descontinuado.</td></tr><tr><td>Prato de imagem com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Tampa de vidro #0 não revestida.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenol.</td></tr><tr><td>Suplementos de meio de crescimento de células endoteliais</td><td>PromoCell</td><td>C-39210</td><td>Omitir o soro fetal de bezerro.</td></tr><tr><td>Laser de femtossegundo FemtoTrain</td><td>Espectro-Física</td><td>1040-5</td><td>Potência Média: >5,0 W, Energia de Pulso: >500 nJ, Comprimento de Onda: 1040 nm &plusmn; 8 nm, Taxa de repetição: 10 MHz, Largura de pulso (FWHM): < 220 fs.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone caracterizado.</td></tr><tr><td>Decapador de fibras</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavina adenina dinucleotídeo dissódico sal hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>Espelhos galvanômetros</td><td>Tecnologia Cambridge</td><td>6215H</td><td>Descontinuado.</td></tr><tr><td>Estação de trabalho para processamento de vidro</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ImagemJ</td><td>Laboratório Eliceiri na Universidade de Wisconsin Madison</td><td>Versão 2.16.0</td><td>Distribuição FIJI.</td></tr><tr><td>Papel de seda Kimwipe</td><td>Profissional da Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Platina de microscópio</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de platina para microscópio</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autocorrelator de microscopia</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olimpo</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Imersão em água, ampliação de 25X, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Medidor de potência óptica</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>Analisador de espectro óptico</td><td>ThorLabs</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de cristal fotônico</td><td>Fotônica NKT</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Grande área de modo, manutenção da polarização. Diâmetro do núcleo: 15 €</td></tr><tr><td>Cutelo de fibra óptica de precisão</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Modelador de pulso</td><td>Soluções Biofotônicas Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Descontinuado.</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, hidrato de sal dissódico reduzido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

A abordagem multicanal e multimodal complexa do microscópio SLAM (Figura 1) pode dificultar a solução de problemas e a compreensão dos resultados por novos usuários. Primeiro, um PCF bem clivado apresenta uma face limpa (Figura 2C) com uma superfície plana perpendicular ao comprimento do PCF (Figura 2A). Uma face de clivagem angulada e lascada (Figura 2B) e a presença de arranhões (...

Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

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Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

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Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

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Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

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