Name: Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a gerar mutantes maternos em zebrafish usando a linha zpc:cas9 knock-in e entrega Tol2 de cassettes sgRNA. Este método eficiente permite estudar fatores maternos associados a mutações zigóticas que causam letalidade ou esterilidade.

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<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x mistura de PCR M5 HiPer Taq</td><td>Mei5bio</td><td>Gato # MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MDbio</td><td>Gato#A006L</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep de Plasmídeo AxyPrep</td><td>Axygen</td><td>Gato#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de eletroforese capilar (Qsep400)</td><td>Biótico</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de rotulagem DIG</td><td>Roche</td><td>Gato#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>Gato#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Gato#R0861</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA de primeira fita</td><td>TransGen Biotech</td><td>Gato#AT301</td><td></td></tr><tr><td>GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease</td><td>GenScript</td><td>Gato#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro (1,0 x 100 mm)</td><td>Fábrica de Equipamentos Educacionais Rantai</td><td>Gato#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>Glicogénio</td><td>Ciência da Vida BBI</td><td>Gato#28985</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>ImagemJ</td><td>Código aberto</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão</td><td>Biotecnologia</td><td>Gato#CA1351</td><td></td></tr><tr><td>Microforge (MF2)</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microespectrofotômetro (Nano-300)</td><td>ALLSHENG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OlyVIA</td><td>OLIMPO</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Gato#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Injetor de Pico-Litro (PLI-100A)&nbsp;</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinças pontiagudas</td><td>WPI</td><td>Gato#500341</td><td></td></tr><tr><td>Pinças pontiagudas</td><td>&nbsp; WPI&nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>Extrator (PC-100)</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase RiboLock</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Gato#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Gato#R0481</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos de hidroxila de silício</td><td>Sangon Biotech</td><td>Cat#B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>RNA polimerase T7</td><td>NEB</td><td>Gato # M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Zold</td><td>WPI</td><td>Moldes z Cat#</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Geração rápida de mutantes maternos rbm24a Construímos um vetor transgênico que permite a expressão de um marcador materno de BFP e quatro sgRNAs altamente eficientes direcionados à sequência codificadora rbm24a. Após a introdução deste vetor em embriões homozigotos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 via transposição de Tol2, Mrbm24a foi fácil e rapidamente identificado entre embriões F1 positivos para BFP devido à ausência ...

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Um guia passo-a-passo para a geração de embriões alvo zebrafish quimérico de transplante em fase de blástula ou gástrula.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de embriões para entregar compostos no saco vitelino de peixe-zebra.

Microinjeção de embriões: uma técnica para entregar um composto na gema do peixe-zebra

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Um protocolo optimizado para a maturação in vitro de oócitos de peixe-zebra utilizados para a manipulação dos produtos dos genes maternos é aqui apresentada.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

Este protocolo descreve uma abordagem para facilitar edições precisas em embriões de peixe-zebra usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Um pipeline de fenotipagem é apresentado para demonstrar a aplicabilidade dessas técnicas para modelar uma variante gênica associada à Síndrome do QT Longo.

Edições de knock-in precisas mediadas por CRISPR-Cas9 em corações de peixe-zebra

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

Aprenda a gerar mutantes maternos em zebrafish usando a linha zpc:cas9 knock-in e entrega Tol2 de cassettes sgRNA. Este método eficiente permite estudar fatores maternos associados a mutações zigóticas que causam letalidade ou esterilidade.

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

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