Produção baseada em microbioreadores de células estromais mesenquimatosais dependentes de ancoragem, preparadas para a síndrome aguda de desconforto respiratório
12 de dezembro de 2025
Um protocolo é descrito para a produção de células dependentes de ancoragem por microtransportadores-microbioretores como potenciais terapias baseadas em células. Focando em um caso de uso da síndrome de desconforto respiratório agudo, o rendimento celular comparável e a expressão gênica favorável em relação às condições de processo baseadas em frascos são ilustrados. Esse protocolo é extensível para outras células dependentes da ancoragem e indicações de alvo.
Estudamos como as células interagem com seu ambiente, inclusive ao produzir ou fabricar células como terapias. Aqui, abordamos questões sobre como células dependentes de ancoragem, como MSCs, estromais mesenquimatosais ou células-tronco, podem ser produzidas para superar algumas barreiras à tradução clínica. O reconhecimento crescente de que a variabilidade da população celular afeta tanto a consistência quanto a potência do produto celular final para cada lote ou pessoa.
Esses desafios podem até afetar a aprovação regulatória de algumas terapias celulares. Nosso objetivo é uma lacuna que permita alcançar um alto número de células por mililitro de fluido com alto controle do ambiente e de uma forma que possa ser ampliada. Esse protocolo oferece uma forma de incluir monitoramento ambiental inline para células dependentes da ancoragem, como as MSCs.
Esse controle de processo é uma vantagem em relação aos frascos que ainda são usados na maioria das produções laboratoriais e clínicas. Existem várias questões em aberto para MSCs e outros tipos celulares sensíveis a sinais mecânicos. Por exemplo, como esse tipo de abordagem pode ajudar a desenvolver células para enfrentar outros estados de doença?
Para começar, remova a tampa plástica transparente conectada ao LL da garrafa no suporte de garrafas. Usando uma nova seringa estéril de 50 mililitros sem êmbolo, conecte o bico à garrafa LL. Despeje a água filtrada estéril no barril da seringa e injete na garrafa LL. Da mesma forma, enche a garrafa L com 25 mililitros de DMEM de baixa glicemia sem FBS, a garrafa R com 25 mililitros de PBS estéril e a garrafa RR com oito mililitros de solução antiaderente para enxágue. Repita o procedimento para preparar o número necessário de consumíveis para o experimento.
Em seguida, realize um autoteste em cada cápsula a ser usada no experimento. Depois que o pod passar com sucesso em todas as verificações do autoteste, retire as fitas auto-testadas e coloque-as em sacos de armazenamento protegidos contra luz. Monte o consumível no biorreator.
Remova a fita verde das válvulas de consumíveis e instale o consumível na cápsula. Reinstale as grampos e verifique se há algum chiado para confirmar que a vedação está firme. Conecte a linha branca do sensor de pressão, a linha vermelha de pressão do ar e a linha azul de vácuo entre o consumível e a estação base ou pod.
Confirme que a porta lateral de injeção está fechada usando uma grampa em forma de lágrima branca antes de iniciar um novo experimento. Clique no ícone Flush Bottles na interface do software. Ative o botão de acesso para a garrafa L, selecione Saída para Desperdício, depois clique em Iniciar Lavar MSCserum.
Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique que o MSCserum está localizado na garrafa R, que contém PBS. Depois, navegue para Operações Manuais e realize três ciclos de Ejeção e Lavagem na garrafa de resíduos. Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique que o MSCserum agora está localizado na RR da garrafa, que contém a solução antiaderente para enxágue.
Volte para Operações Manuais e realize um ciclo de Ejeção e Lavagem na garrafa de resíduo. Após 30 minutos, enxágue o consumível com PBS. Esvazie o reator para aguardar a injeção de células e microtransportadores.
No painel de Operações Manuais, clique em Reinocular. Deixe o sistema pausado na fase em que o painel exibe um aviso para inocular o reator. Em seguida, pipete-se um volume calculado de células ressuspensas em um tubo cônico de 15 mililitros contendo microtransportadores para cada condição.
Complete cada tubo entre 2,2 e 2,5 mililitros com meio de células-tronco mesenquimatosas humanas frescas e quentes. Trabalhando com um ou dois consumíveis por vez, remova-os da estação base e coloque-os no gabinete de biossegurança. Retire a mistura de célula e microtransportador em uma seringa de cinco mililitros usando uma agulha verde de quatro polegadas.
Injete a mistura no reator. Segure a linha da porta de injeção próxima à base do, tomando cuidado para não desprender a linha. Usando um movimento de rolamento entre o polegar e o indicador, torça a linha da porta de injeção por duas rotações completas para criar uma dobra com nós na linha.
Coloque o nó no espaço de abertura próximo à base da porta de injeção e prenda-o com um pequeno pedaço de fita de laboratório. Depois, devolva o consumível para a estação base. Após repetir a injeção para todos os consumíveis, navegue pela interface do software para indicar que a inoculação foi concluída.
Quando o software retorna à página inicial, remova o grampo branco das linhas de saída dos consumíveis. Entre em operação manual e execute a função Ejetar Excesso com a Porta de Saída definida para P para perfusão. Ative o modo de Mistura Estática usando um ciclo de 1.680 segundos ligado e 120 segundos desligado, e defina a Frequência de Mistura para cinco hertz.
Para iniciar a colheita celular, use uma seringa de um mililitro para extrair 200 microlitros de Pronase e aproximadamente 300 a 400 microlitros de ar. Desrosqueie a tampa da linha de injeção lateral e borrife o conector da válvula sem agulha com etanol a 70%. Remova a fita da linha de injeção lateral com nó, desamarre o nó e desaperte a grampa branca em forma de gota.
Agora, conecte a seringa de um mililitro e injete delicadamente a Pronase no reator. Corra o líquido com ar para garantir a entrega completa. Reprenda a gramposa em gota e refaça a linha de injeção.
Depois, devolve o consumível ao pod, reconecta todas as linhas, remove o C-clamp branco e retoma a mistura. Coloque a garrafa de resíduos e a garrafa de fonte de mídia no gelo. Inicie um temporizador de cinco minutos e permita que a Pronase digera os microtransportadores no reator.
Após cinco minutos, verifique se os microtransportadores se degradaram verificando sua ausência no reator. Colha as células entrando em Operações Manuais, defina o número de ciclos para três, escolha Porta de Saída W para resíduo e clique em Ejetar Lavagem. Após os ciclos de Eject Wash terminarem, transfira o consumível para o gabinete de biossegurança.
Depois, retire o conteúdo do frasco de resíduos usando uma seringa de 10 ou 20 mililitros. Dispense o conteúdo do frasco de resíduos em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Centrifuge as células a 300g por cinco minutos.
Aspire o sobrenadante e avalie o tamanho do pellet celular. As condições ambientais, incluindo pH, temperatura, oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, foram mantidas de forma estável durante todo o período de cultura de 10 dias no sistema microbioragile. A variação do pH foi significativamente menor no microbiorator em comparação com a condição do frasco de poliestireno em cultura tecidual.
O rendimento celular foi maior no microbiorator do que no frasco T25, mantendo viabilidade celular semelhante. Dos 14 atributos críticos de qualidade associados à potência medidos, nove apresentaram expressão significativamente maior de mRNA na condição do microbioreator em relação ao frasco T75.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para produzir células dependentes de aderência, como células estromais mesenquimais (MSCs), em um sistema de microbiorreator. Tem como objetivo enfrentar os desafios da tradução clínica mediante a melhoria do rendimento celular e da consistência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapias baseadas em células
- Tecnologia de microcarregadores
- Sistemas de biorreator
Antecedentes
- Células dependentes de aderência são fundamentais para diversas terapias.
- A variabilidade da população celular pode afetar a consistência e a potência do produto.
- A aprovação regulatória pode ser afetada por desafios na fabricação.
- A produção de células em alta densidade é essencial para aplicações terapêuticas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método escalonável para a produção de MSCs.
- Melhorar o controle ambiental durante o cultivo celular.
- Facilitar o monitoramento em linha das condições de crescimento celular.
Métodos Utilizados
- Sistema de microcarregador-microbiorreator para cultura celular.
- Técnicas de monitoramento ambiental integradas ao processo.
- Comparação do rendimento celular e da expressão gênica com métodos tradicionais.
- Aplicação na síndrome do desconforto respiratório agudo como um caso de uso.
Resultados Principais
- Rendimento celular comparável ao dos processos baseados em frascos.
- Perfis favoráveis de expressão gênica observados.
- Protocolo extensível a outras células dependentes de aderência.
- Alto controle sobre as condições de cultura alcançado.
Conclusões
- Este protocolo oferece uma solução viável para a produção de MSCs.
- Ele aborda barreiras fundamentais para a aplicação clínica de terapias celulares.
- Potencial para melhorar a conformidade regulatória por meio de maior consistência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A expansão baseada em microbioreatores de células estromais mesenquimais (MSCs) dependentes de aderência aborda gargalos críticos na produção de terapias celulares, permitindo a produção com alto rendimento e controle de qualidade em escala de bancada. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva na consistência e potência do produto celular, apoiando a continuidade translacional para a síndrome do desconforto respiratório agudo e outras indicações. O controle rigoroso do ambiente e a escalabilidade do método o posicionam como um ativo estratégico para o desenvolvimento inicial de processos e triagem de portfólios em terapêuticas baseadas em células.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de interações entre célula e ambiente relevantes para testes de hipóteses terapêuticas.
- Apóia a validação funcional de MSCs ao manter atributos críticos de qualidade durante a expansão.
- Facilita a redução de riscos biológicos por meio de condições de cultura controladas e reprodutíveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara populações validadas de CMM para ensaios posteriores de potência e qualidade.
- Padroniza as condições de expansão para melhorar a reprodutibilidade e a comparabilidade quantitativa.
- Fornece produção escalonável de células com alto rendimento, adequada para triagem e otimização de processos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a fabricação de células com modelos relevantes para a síndrome do desconforto respiratório agudo.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, preservando o fenótipo e a potência celular.
- Reduz o risco de falha em estágios avançados ao apoiar princípios robustos de fabricação baseados em qualidade por projeto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de microbiorreator se integra à continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo um desenvolvimento rápido do processo, avaliação precoce da qualidade e transição escalonável para plataformas de produção maiores.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma plataforma para testes baseados em hipóteses da função das CMM e sua resposta ao ambiente.
- Triagem: Garante populações celulares prontas para ensaios, reprodutíveis e com métricas quantitativas de saída.
- Análises: Permite o monitoramento em tempo real de pH, gases dissolvidos e atributos críticos de qualidade para tomada de decisões baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta o desenvolvimento de processos em laboratório com modelos pré-clínicos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho modular e adaptável para diversos tipos celulares dependentes de aderência e indicações.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na qualidade e potência do produto celular.
- Valor Operacional: Oferece expansão celular padronizada, escalonável e reprodutível com controle rigoroso do ambiente.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e reduz o risco de falhas biológicas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco dos candidatos a terapia celular.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em operação de biorreatores e cultivo de células dependentes de aderência.
- Requer acesso a instrumentação de microbiorreatores e sistemas de monitoramento ambiental em linha.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros do processo e métricas de qualidade.
- Adaptável a diversas fontes celulares mediante otimização específica do processo.
- A escala física e a produtividade podem limitar a transposição direta para produção em larga escala sem escalonamento adicional.
