Produção baseada em microbioreadores de células estromais mesenquimatosais dependentes de ancoragem, preparadas para a síndrome aguda de desconforto respiratório

Estudamos como as células interagem com seu ambiente, inclusive ao produzir ou fabricar células como terapias. Aqui, abordamos questões sobre como células dependentes de ancoragem, como MSCs, estromais mesenquimatosais ou células-tronco, podem ser produzidas para superar algumas barreiras à tradução clínica. O reconhecimento crescente de que a variabilidade da população celular afeta tanto a consistência quanto a potência do produto celular final para cada lote ou pessoa.

Esses desafios podem até afetar a aprovação regulatória de algumas terapias celulares. Nosso objetivo é uma lacuna que permita alcançar um alto número de células por mililitro de fluido com alto controle do ambiente e de uma forma que possa ser ampliada. Esse protocolo oferece uma forma de incluir monitoramento ambiental inline para células dependentes da ancoragem, como as MSCs.

Esse controle de processo é uma vantagem em relação aos frascos que ainda são usados na maioria das produções laboratoriais e clínicas. Existem várias questões em aberto para MSCs e outros tipos celulares sensíveis a sinais mecânicos. Por exemplo, como esse tipo de abordagem pode ajudar a desenvolver células para enfrentar outros estados de doença?

Para começar, remova a tampa plástica transparente conectada ao LL da garrafa no suporte de garrafas. Usando uma nova seringa estéril de 50 mililitros sem êmbolo, conecte o bico à garrafa LL. Despeje a água filtrada estéril no barril da seringa e injete na garrafa LL. Da mesma forma, enche a garrafa L com 25 mililitros de DMEM de baixa glicemia sem FBS, a garrafa R com 25 mililitros de PBS estéril e a garrafa RR com oito mililitros de solução antiaderente para enxágue. Repita o procedimento para preparar o número necessário de consumíveis para o experimento.

Em seguida, realize um autoteste em cada cápsula a ser usada no experimento. Depois que o pod passar com sucesso em todas as verificações do autoteste, retire as fitas auto-testadas e coloque-as em sacos de armazenamento protegidos contra luz. Monte o consumível no biorreator.

Remova a fita verde das válvulas de consumíveis e instale o consumível na cápsula. Reinstale as grampos e verifique se há algum chiado para confirmar que a vedação está firme. Conecte a linha branca do sensor de pressão, a linha vermelha de pressão do ar e a linha azul de vácuo entre o consumível e a estação base ou pod.

Confirme que a porta lateral de injeção está fechada usando uma grampa em forma de lágrima branca antes de iniciar um novo experimento. Clique no ícone Flush Bottles na interface do software. Ative o botão de acesso para a garrafa L, selecione Saída para Desperdício, depois clique em Iniciar Lavar MSCserum.

Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique que o MSCserum está localizado na garrafa R, que contém PBS. Depois, navegue para Operações Manuais e realize três ciclos de Ejeção e Lavagem na garrafa de resíduos. Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique que o MSCserum agora está localizado na RR da garrafa, que contém a solução antiaderente para enxágue.

Volte para Operações Manuais e realize um ciclo de Ejeção e Lavagem na garrafa de resíduo. Após 30 minutos, enxágue o consumível com PBS. Esvazie o reator para aguardar a injeção de células e microtransportadores.

No painel de Operações Manuais, clique em Reinocular. Deixe o sistema pausado na fase em que o painel exibe um aviso para inocular o reator. Em seguida, pipete-se um volume calculado de células ressuspensas em um tubo cônico de 15 mililitros contendo microtransportadores para cada condição.

Complete cada tubo entre 2,2 e 2,5 mililitros com meio de células-tronco mesenquimatosas humanas frescas e quentes. Trabalhando com um ou dois consumíveis por vez, remova-os da estação base e coloque-os no gabinete de biossegurança. Retire a mistura de célula e microtransportador em uma seringa de cinco mililitros usando uma agulha verde de quatro polegadas.

Injete a mistura no reator. Segure a linha da porta de injeção próxima à base do, tomando cuidado para não desprender a linha. Usando um movimento de rolamento entre o polegar e o indicador, torça a linha da porta de injeção por duas rotações completas para criar uma dobra com nós na linha.

Coloque o nó no espaço de abertura próximo à base da porta de injeção e prenda-o com um pequeno pedaço de fita de laboratório. Depois, devolva o consumível para a estação base. Após repetir a injeção para todos os consumíveis, navegue pela interface do software para indicar que a inoculação foi concluída.

Quando o software retorna à página inicial, remova o grampo branco das linhas de saída dos consumíveis. Entre em operação manual e execute a função Ejetar Excesso com a Porta de Saída definida para P para perfusão. Ative o modo de Mistura Estática usando um ciclo de 1.680 segundos ligado e 120 segundos desligado, e defina a Frequência de Mistura para cinco hertz.

Para iniciar a colheita celular, use uma seringa de um mililitro para extrair 200 microlitros de Pronase e aproximadamente 300 a 400 microlitros de ar. Desrosqueie a tampa da linha de injeção lateral e borrife o conector da válvula sem agulha com etanol a 70%. Remova a fita da linha de injeção lateral com nó, desamarre o nó e desaperte a grampa branca em forma de gota.

Agora, conecte a seringa de um mililitro e injete delicadamente a Pronase no reator. Corra o líquido com ar para garantir a entrega completa. Reprenda a gramposa em gota e refaça a linha de injeção.

Depois, devolve o consumível ao pod, reconecta todas as linhas, remove o C-clamp branco e retoma a mistura. Coloque a garrafa de resíduos e a garrafa de fonte de mídia no gelo. Inicie um temporizador de cinco minutos e permita que a Pronase digera os microtransportadores no reator.

Após cinco minutos, verifique se os microtransportadores se degradaram verificando sua ausência no reator. Colha as células entrando em Operações Manuais, defina o número de ciclos para três, escolha Porta de Saída W para resíduo e clique em Ejetar Lavagem. Após os ciclos de Eject Wash terminarem, transfira o consumível para o gabinete de biossegurança.

Depois, retire o conteúdo do frasco de resíduos usando uma seringa de 10 ou 20 mililitros. Dispense o conteúdo do frasco de resíduos em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Centrifuge as células a 300g por cinco minutos.

Aspire o sobrenadante e avalie o tamanho do pellet celular. As condições ambientais, incluindo pH, temperatura, oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, foram mantidas de forma estável durante todo o período de cultura de 10 dias no sistema microbioragile. A variação do pH foi significativamente menor no microbiorator em comparação com a condição do frasco de poliestireno em cultura tecidual.

O rendimento celular foi maior no microbiorator do que no frasco T25, mantendo viabilidade celular semelhante. Dos 14 atributos críticos de qualidade associados à potência medidos, nove apresentaram expressão significativamente maior de mRNA na condição do microbioreator em relação ao frasco T75.