Name: Explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Explore as interações proteína-glicano usando ressonância magnética nuclear para investigar dinâmica estrutural e forças de superfície no complexo integrina-disintegrina. Este método avança o entendimento de interações fracas em biologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Glicose 13C</td><td>Laboratório Isotópico de Cambrige.</td><td>CLM-481</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio 15N</td><td>Laboratório Isotópico de Cambrige.</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel inibe a protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Laboratório Isotópico de Cambrige.</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>D-manose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td></td><td></td><td>Link para o tutorial do software: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pág. 3786</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pág. 3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pág. 0662</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Shigemi</td><td>Bruker</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S97263</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro Bruker 600 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro Bruker 800 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TXI de ressonância tripla</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

No presente trabalho, apresentamos experimentos de RMN para investigar as interações proteína-glicano. O reconhecimento molecular de proteína-glicano está subjacente a vários processos biológicos envolvendo a matriz extracelular (MEC), incluindo a regulação da adesão celular, migração, proliferação e várias outras formas de comunicação celular.
Aqui, optamos por trabalhar com o monossacarídeo D-manose, que é descrito como um aglutinante fraco. O objetivo foi descrever métodos para medir intera...

Explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear

Protein-glycan interactions are central to many biological processes and are increasingly recognized as promising targets for diagnostic strategies in ...

Estudamos as interações proteína-proteína e proteína-glicano, com foco no complexo integrina-desintegrina. Nosso modelo explora a dinâmica estrutural e destaca o papel da força de superfície na mediação da formação complexa e da estabilidade da interação. Nosso grupo se dedica ao estudo do papel das forças de superfície no reconhecimento molecular e na evolução dos sítios de ligação, estudando aglomerados hidrofóbicos de superfície presentes em proteínas.A solução de RMN permite a detecção de interações proteicas. Embora as interações fracas sejam essenciais para a vida, há um viés para complexos de alta afinidade, embora estejam presentes em muitas funções biológicas importantes. Nosso grupo está se concentrando no uso de abordagens integrativas de biologia estrutural para estudar grandes complexos proteicos.Estamos usando a RMN como principal ferramenta para estudar a dinâmica e os aspectos funcionais. Para começar, prepare uma solução de quatro milimolares de D-manose em tampão fosfato de sódio a pH 7,4 com cloreto de sódio 50 milimolar e óxido de deutério a 5%. Divida a solução em duas amostras, uma contendo 80 micromolares CVN e a segunda sem.Para mapear a ligação do ligante por meio de perturbação de deslocamento químico no espectrômetro de RMN, configure a sequência de pulso HSQCTOPSI para aquisição de H1C13 HSQC. Configure o domínio do tempo, a largura espectral, a frequência da portadora e o número de varreduras. Calcule a perturbação do deslocamento químico usando a equação fornecida.Para mapear a ligação do ligante por meio da diferença de transferência de saturação, primeiro crie um novo conjunto de dados. Configure os parâmetros para experimentos de RMN de DST rastreando diferentes frequências de saturação ou fixando a frequência enquanto varia os tempos de saturação para avaliar o acúmulo. Configure experimentos de RMN 1D H1 usando a sequência de pulso ZGPR.Ajuste o espectrômetro para H1, execute o calço e meça um pulso forte de 90 graus. Centralize a frequência da portadora aproximadamente em 4.7 partes por milhão, correspondendo ao sinal de água, e selecione o STDDIFFESGP. 3 sequência de pulsos e defina os parâmetros de aquisição.Defina a largura espectral conforme necessário, o atraso de intervarredura D1 para quatro segundos e defina o tempo de saturação D20, de acordo com os objetivos do experimento. Carregue a lista FQ2 com frequência de ressonância em menos 40 partes por milhão e frequências de ressonância apenas para saturar a proteína. Teste as frequências de ressonância de menos 0,59, 0,73 e 8,1 partes por milhão para determinar as condições ideais.Use a frequência ideal para adquirir espectros de DST em tempos de saturação de 0,5, um, 1,5, dois, 2,5, três e quatro segundos. Plote os valores ASTD correspondentes em função do tempo de saturação. Agora, defina o número de varreduras para 64 e calcule a média do loop do experimento quatro vezes.Em seguida, calcule o número total de varreduras. Defina o atraso entre varreduras para quatro segundos e o tempo de aquisição para 2,7262976 segundos. Configure o pulso de saturação definindo a duração para 50 milissegundos e controle da forma gaussiana através do programa de forma 9SP9.Aplique um filtro de linha T1 na variante STD NMR e, em seguida, defina o tempo de bloqueio de rotação D29 com base no tamanho da proteína. Para mapear a ligação do ligante H1 R2, primeiro selecione o programa de pulso CPMG_ESGP2D na biblioteca padrão Bruker. Defina o experimento como uma aquisição 2D.Configure os parâmetros de aquisição conforme mostrado. Em seguida, execute o experimento por 200 ciclos de oito varreduras cada. Ajuste a lista de contadores de variáveis de acordo com o tempo total desejado do ciclo CPMG.Execute dois experimentos, um para a amostra com a proteína e outro para a amostra somente ligante. Plote os espectros H1 para cada TCPMG usando o comando EFP ou seno M seguido de FP e, em seguida, ajuste a função da janela de acordo com a melhor estratégia de processamento. Calcular o quociente CPMG Q utilizando a equação.Adquira H1N15HSQC espectros de CVN marcado com N15 a 298 Kelvin. Titular com D-manose para atingir as concentrações finais de zero, um, dois, cinco, 10, 20, 40 e 60 milimoles. Use a sequência de pulso HSQC rápida FHSQCF3GPPH sensível à fase da biblioteca padrão Bruker.Em seguida, calcule a perturbação do deslocamento químico usando a fórmula. Representar graficamente os valores de CSP para cada resíduo em função da concentração de D-manose para determinar a constante de dissociação KD utilizando a equação cinco. Em seguida, ajuste os dados resultantes a uma única isoterma de associação usando a fórmula.Use a sequência de pulso de HSQCT2ETF3GPSI3D sensível à fase e configure os parâmetros mostrados para medir os valores N15 R2 dos resíduos individuais de resíduos CVN na ausência e presença de D-manose 60 milimolar a 298 Kelvin. Processe espectros pseudo-tridimensionais usando NMRPipe para gerar espectros semelhantes a HSQC para cada atraso de relaxamento. Importe os espectros processados para uma plataforma de análise.Em seguida, selecione todos os espectros e aplique a ferramenta de alterações de intensidade a seguir. Plotar a intensidade de cada pico cruzado em função do relaxamento de T e ajustar o decaimento a uma função monoexponencial para extrair os valores de N15 R2 para cada resíduo. Calcule o erro experimental a partir da relação sinal-ruído dos espectros do tipo HSQC em 67,84 milissegundos.Processe uma região do espectro contendo apenas ruído e converta-a em um arquivo de texto usando o comando fornecido. Em seguida, determine o desvio padrão da região do ruído ou intensidade do ruído usando software estatístico. Calcule o erro experimental usando a equação fornecida.Perturbações de deslocamento químico foram observadas para ambas as formas anoméricas de D-manose na presença de CVN, com maiores deslocamentos observados na beta-D-manose, indicando ligação preferencial. Dois picos distintos foram observados para a maioria dos hidrogênios D-manose na presença de CVN, correspondendo aos estados livre e ligado. Os núcleos de hidrogênio que exibiram os maiores valores de ASTD foram associados à beta-D-manose, consistente com fortes interações bipolares com CVN.Na análise da taxa de relaxamento transversal, H beta quatro foi o único próton que exibiu um aumento notável no relaxamento ao se ligar ao CVN. As perturbações de deslocamento químico H1 e N15 induzidas pela adição de um ligante foram maiores em concentrações de até 10 milimolares. Os resíduos I40, E41, N42, V43, D44 e G45 dentro da fita beta mostraram perturbações significativas de deslocamento químico, identificando-os como o sítio de ligação de alta afinidade para D-manose.As isotermas de ligação mostraram que o resíduo D44 teve a maior afinidade entre os resíduos da fita beta, com uma constante de dissociação de aproximadamente um milimolar. A medição das taxas de relaxamento de N15 R2 mostrou aumentos e diminuições nos valores de delta R2 após a ligação de D-manose, sugerindo uma mistura de estabilização conformacional e processos de troca. Os resíduos C58, R59, K74 e R76 demonstraram valores aumentados de delta R2, confirmando seu envolvimento no sítio de ligação de alta afinidade, enquanto os resíduos F4, C8, R24 e G27 representaram a região de baixa afinidade.

exploring-protein-glycan-interactions-advances-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear para estudar as interações proteína-proteína entre 15proteínas envoplakin mutantes e do tipo selvagem marcadas com N e a proteína vimentina não marcada. A interação bem-sucedida entre a envoplaquina do tipo selvagem e a vimentina leva a um extenso alargamento da linha e ao desaparecimento do pico nos espectros de RMN, enquanto a ausência de uma interação entre a envoplaquina mutada e a vimentina resulta em picos...

Ressonância Magnética Nuclear para Estudo de Interações Proteína-Proteína em Nível Atômico

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Este protocolo ilustra como explorar, comparar e interpretar as proteínas humanas com recursos on-line.

Recursos bioinforáticos para o estudo de interações proteicas mediadas por glicanos

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.

Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

As interações de fatores de transcrição (TFs) com a RNA polimerase são geralmente estudadas usando ensaios de pulldown. Nós aplicamos uma tecnologia da interferometria de Biolayer (BLI) para caracterizar a interação de GrgA com o polymerase do RNA do chlamydial. Comparado aos ensaios de pulldown, o BLI detecta associação e dissociação em tempo real, oferece maior sensibilidade e é altamente quantitativo.

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

Explore as interações proteína-glicano usando ressonância magnética nuclear para investigar dinâmica estrutural e forças de superfície no complexo integrina-disintegrina. Este método avança o entendimento de interações fracas em biologia.

Explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear

Explorar mais vídeos