Linfodenectomia mesentérica murina para interrupção seletiva da comunicação linfática com intestino específico de região

Nossa pesquisa foca nas respostas das células T a neoantígenos e tecidos periféricos, e essas respostas são fortemente influenciadas pelo priming, então focamos principalmente em onde esses eventos de priming ocorrem. Atualmente, as únicas opções amplamente utilizadas para bloquear o tráfego entre linfonodos e tecidos são modalidades sistêmicas como agonistas do receptor S1P e o bloqueio da integrina. Mas essa ampla inibição nos impede de estudar a contribuição de linfonodos locais específicos.

Nosso protocolo fornece uma descrição detalhada das linfadenectomias altamente seletivas em cada uma das quatro principais estações mesentéricas dos linfonodos e, como esses linfonodos são bastante especializados no segmento intestinal que drenam, esse procedimento de sobrevivência bem tolerado nos permite perturbar segmentos específicos do eixo linfático intestinal enquanto deixamos o restante intacto. Após confirmar a profundidade anestésica adequada com uma pinça no pé traseiro, use tesoura cirúrgica estéril para fazer uma incisão na linha média da pele de 0,5 a 1 centímetro no rato anestesiado. Usando pinças estériles, dissece a pele da parede abdominal e identifique a linha alba.

Depois, faça outra incisão de 0,5 a 1 centímetro através da linha alba para acessar a cavidade peritoneal. Usando uma agulha de ponta romba, injete um mililitro de soro fisiológico estéril à temperatura corporal na cavidade peritoneal. Umedecida as cortinas estéreis para preparar a posição intestinal.

Para ressecar a primeira estação linfonodária, oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas úmidas com o ceco posicionado inferiormente, o cólon proximal acima e o íleo terminal voltado para o cirurgião. Identifique a cadeia mesentérica do gânglio linfático que corre longitudinalmente ao longo do cólon. Usando pinças de ponta fina e angular, dissece de forma direta a primeira estação linfânica afastando-se dos vasos ileocólicos, colocando as pinças fechadas entre essas estruturas e abrindo-as suavemente.

Para reduzir o risco teórico de fluxo colateral para os linfonodos próximos, realize uma ligadura opcional com suturas simples interrompidas ao longo da cadeia linfática, um milímetro distal e um milímetro proximal à primeira estação linfântica, utilizando sutura monofilamento de nylon e pinças de ponta fina. Retraa suavemente a estação linfonodária caudal e, usando tesouras de ponta fina, excise a estação linfântica alvo da cefálade para a direção caudal. Observe os ramos distais dos vasos ileocólicos, ileais e jejunais para confirmar que o suprimento sanguíneo permanece intacto.

Para ressecar a segunda estação linfânica, eviscere suavemente o intestino delgado e oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas umedecidas, com o ceco posicionado inferiormente, o cólon proximal acima e o intestino delgado para a direita do cirurgião. Em seguida, identifique a segunda estação linfonodal, que corre longitudinalmente ao longo do cólon e começa na confluência dos vasos ileal e jejunal. Usando pinças finas e angulares, dissece de forma direta a segunda estação linfonodal, afastando-a dos vasos do cólon.

Para reduzir o risco teórico de fluxo colateral para os linfonodos próximos, realize uma laqueadura opcional com suturas simples interrompidas ao longo da cadeia linfática, um milímetro distal e um milímetro proximal à segunda estação linfânica, utilizando ponta monofilamento de náilon e pinças de ponta fina. Retraa suavemente a estação do linfonodo caudal e, usando tesoura de ponta fina, excise a segunda estação do gânglio linfático da cefala para a direção caudal. Inspecione o campo operatório para garantir hemostasia.

Para ressecar a quarta estação linfonodária, eviscere suavemente todo o intestino delgado até o ponto posterior de amarração. Oriente o intestino sobre cortinas umedecidas com o ceco inferior, o cólon proximal em cima e o intestino delgado para a direita do cirurgião. Identifique a quarta estação linfonodal, que fica logo na medial do cólon distal e lateral na terceira estação.

Usando pinças de ponta fina angulares ou tesouras de ponta extra-fina, dissece de forma direta a quarta estação linfonodal dos vasos do cólon e do tecido adiposo ao redor. Para reduzir o risco teórico de fluxo colateral para os linfonodos próximos, realize uma ligadura opcional com suturas simples interrompidas em cada linfonodo identificável, geralmente a um milímetro do nódulo, utilizando sutura monofilamento de nylon e pinças de ponta fina. Depois, retraa suavemente a quarta estação linfonodal, cefálade.

Usando tesouras de ponta fina ou extra-fina, excise as estações linfáticos da caudal para a cefálada. Repita o procedimento para o segundo linfonodo na quarta estação linfânica. Dissecar cuidadosamente o nó, realizar a ligadura de sutura se necessário e ressecá-lo.

Inspecione o campo operatório para confirmar hemostasia. Após retornar o conteúdo abdominal à cavidade peritoneal, injete um mililitro de soro fisiológico estéril à temperatura corporal na cavidade abdominal para compensar a perda de líquido evaporativo. Feche o abdômen em duas camadas: primeiro a parede abdominal, depois a pele usando um ponto de polipropileno monofilamento 6-0 em padrão de corrida.

Tecido extraído por meio do procedimento de linfadenectomia mesentérica consistentemente resultou em amostras com baixo teor de adiposo, como evidenciado pela queda imediata no PBS. A análise de citometria de fluxo confirmou a extração bem-sucedida dos linfonodos, com mais de 95% das células em amostras derivadas da linfadenectomia mesentérica identificadas como CD45 positivas, em comparação com apenas 7% nos controles do tecido visceral adiposo.