Name: Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a técnica I-GONAD para edição genômica em camundongos usando eletroporação in utero e CRISPR/Cas9. Este método simplifica a geração de knockouts com eficiência comparável à microinjeção tradicional.

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<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5&ntraço; 5 uL pipeta&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 uL pipeta&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 200 uL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 uL pipeta&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 uL pipeta&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x Gel Loading Dye</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AppliChem</td><td>A8963.0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, livre de RNase (1 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto dNTP, solução de 100 mM</td><td>Termo Científica</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA Polimerase (5 U/&mu; L)</td><td>Termo Científica</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s soro fosfatado tamponado modificado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Análise ICE da EditCo</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>acessado em 06.04.2025</td></tr><tr><td>Solução EDTA 0,5M, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892,0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>acessado em 09.06.2025</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>Gotas de gel para os olhos" Oftagel"</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de documentação em gel ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>In-Silico PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&nbsp; acessado em 09.06.2025</td></tr><tr><td>Tecnologias Integradas de DNA & nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>acessado em 09.06.2025</td></tr><tr><td>Tesoura microcirúrgica</td><td>URAIS de Medin</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador NEPA21</td><td>Nepa Gene</td><td>NEPA21</td><td>Com eletrodo CUY652P2,5X4</td></tr><tr><td>NTP Set, Solução de 100 mM</td><td>Termo Científica</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Evrogen</td><td></td><td>Purificação padrão por dessalinização por ordem direta</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Médio Sérico Reduzido</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>Versão 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion Alta Polimerase de DNA de Alta Fidelidade (2 U/&mu; L)</td><td>Termo Científica</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 10 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 1000 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 200 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de energia " Elf-4"</td><td>Tecnologia de DNA</td><td>PS-400 NOVO</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNAse/DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese horisontal SE-1</td><td>Helicon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA Step100</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetador stripper</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de stripper</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>Agulha cirúrgica & nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6 e vezes; 20</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de sutura</td><td>URAIS de Medin</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de sutura</td><td>URAIS de Medin</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>Tópico de sutura POLYCON N<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="margin: auto; "/>0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>Design do Guia Knockout SYNTHEGO &nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>acessado em 09.06.2025</td></tr><tr><td>Amplificador T100</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>RNA polimerase T7 &nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>Buffer TBE 10x</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>acessado em 04.06.2025&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris</td><td>Suzhou Yacoo Science</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloridrato de Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Cas9 TrueCut</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras universais</td><td>URAIS de Medin</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Laboratório Virbac</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

improved-genome-editing-via-oviductal-nucleic-acids-delivery-based

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Genetics

Genética

Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que...

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

O presente protocolo descreve a microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 e DNA do doador para produzir eficientemente camundongos knock-in e floxed de gênico.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Este protocolo descreve microinjeção e eletroporação in vivo para edição do genoma mediada por CRISPR regionalmente restrita no oviduto de camundongos.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.

CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a técnica I-GONAD para edição genômica em camundongos usando eletroporação in utero e CRISPR/Cas9. Este método simplifica a geração de knockouts com eficiência comparável à microinjeção tradicional.

Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout (Vídeo) | JoVE Journal

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