Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

O escopo de nossa pesquisa é simplificar a geração de camundongos knockout utilizando eletroporação in utero, entregando componentes de edição genômica diretamente nos ovidutos de fêmeas grávidas. Microinjeções em zigotos requerem a manutenção de um grande número de animais, incluindo fêmeas doadoras e receptoras e machos vasectomizados. Portanto, protocolos que minimizem o uso de animais são preferíveis.

O uso do sistema Nepa21 para eletroporação de zigotos oferece uma oportunidade única de gerar camundongos nocauteadores de genes direcionados em uma única etapa, com eficiência comparável às técnicas padrão baseadas em injeção nuclear. Para começar, utilize ferramentas de análise computacional para identificar potenciais sequências de RNA guia único que visem o gene selecionado de interesse. Selecione sequências localizadas em éxons que estejam o mais próximas possível do local desejado da mutação. Use um navegador genômico para cruzar a estrutura do exoma e priorizar as sequências presentes na maioria das isoformas de emenda.

Analise a atividade fora do alvo prevista de cada sequência de guias usando o sistema integrado de pontuação da ferramenta. Escolha sequências que demonstrem a menor probabilidade de ligação fora do alvo. Para produzir um modelo linear de DNA de fita dupla, prepare a mistura mestre de PCR usando os componentes especificados na tabela fornecida.

Adicione a polimerase por último e mantenha a mistura master no gelo para preservar a estabilidade enzimática. Depois, execute a PCR usando as seguintes condições de ciclo térmico. Em seguida, prepare a mistura mestre de transcrição in vitro usando os componentes fornecidos e incube a reação por 1,5 hora a 37 graus Celsius usando um termociclador para controle consistente da temperatura.

Depois, adicione dois microlitros de DNase I à reação. Incube a 37 graus Celsius por mais 30 minutos para digerir o molde de DNA e então inative a enzima a 75 graus Celsius por cinco minutos. Após a purificação de RNA pelo Trizol, meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro e verifique as razões A260 para A280 e A260 para A230.

Para preparar o complexo ribonucleoproteico para transfecção, dilua um molar de tampão Tris-HCl a uma concentração de 100 milimolares usando água livre de nuclease. Filtre a solução usando um filtro de seringa com tamanho de poro de 0,022 micrômetro. Aliquota em porções de 10 microlitros e armazene a quatro graus Celsius até o uso.

Em seguida, prepare a mistura de transfecção usando nuclease spCas9, RNA guia simples e Tris-HCl diluídos com água DEPC em um tubo livre de nuclease. Incube a mistura de transfecção a 37 graus Celsius por 10 minutos para permitir a formação do complexo ribonucleoproteico. Depois, aliquota a mistura de transfecção em pequenos volumes adequados para sessões únicas de I-GONAD e mantenha-a a quatro graus Celsius para preservar a atividade do reagente.

Após acasalar fêmeas CD1 com ratos machos CD1 de uma única casa durante a noite, verifique cada fêmea para a presença de um plugue de cópula. Transfira apenas as fêmeas com tampões visíveis para uma nova gaiola para procedimentos experimentais adicionais. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável para garantir a esterilidade antes do uso.

Depois, pese o plug selecionado=camundongos fêmea positivo usando uma balança eletrônica antes de anestesiá-los. Monitore os camundongos anestesiados para a perda do reflexo de pinçar do dedo do pé para confirmar anestesia adequada. Coloque o mouse em uma almofada térmica para manter a temperatura corporal durante o procedimento.

Depois, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Usando tesoura fina, faça uma incisão longitudinal de 0,7 centímetro na pele da região lombar. Depois, abra lateralmente as pontas ligeiramente abertas da tesoura para estender suavemente a incisão da pele até aproximadamente 1,3 centímetro.

Depois disso, faça cuidadosamente uma incisão de 0,7 centímetro no peritônio para expor a cavidade abdominal. Estenda a incisão peritoneal para 1,1 centímetro, empurrando bilateralmente com as pontas de tesoura ligeiramente abertas. Localize a almofada adiposa conectada ao ovário e puxe-a suavemente para fora usando uma pinça até que o ovário, o oviduto e o útero fiquem expostos.

Usando uma pinça para vasos, fixe a almofada adiposa para estabilizar as estruturas reprodutivas. Em seguida, carregue dois microlitros da mistura de injeção de ribonucleoproteína em um capilar plástico descartável usando um pipetador decapador. Usando microtesoura, faça uma incisão de 0,2 centímetro na parede do oviduto, alguns milímetros acima da ampula.

Insira o capilar plástico preso à pipeta removedora na incisão do oviduto e expulse cuidadosamente a mistura de injeção sem introduzir ar. Retirar suavemente o capilar plástico do oviduto para completar a injeção. Ligue o eletroporador pressionando o interruptor de energia no painel frontal.

Defina os parâmetros de eletroporação no dispositivo conforme mostrado na tela. Usando eletrodos tipo pinça, segure suavemente o oviduto e pressione o botão Kiloohm para medir a resistência. Imediatamente após a medição da resistência, pressione o botão Start para iniciar a eletroporação e espere o sinal final aparecer no botão Ohm.

Após a eletroporação do primeiro oviduto, retorne suavemente o trato reprodutor à cavidade abdominal. Feche a incisão usando sutura cirúrgica de ácido poliglicólico 4-0. Para genotipagem, projete primers de 18 a 21 nucleotídeos com temperatura de fusão próxima a 60 graus Celsius para gerar um produto PCR de 300 a 600 pares de bases.

Para confirmar a especificidade de cada primer, realize uma busca BLAST no banco de dados do genoma do camundongo para eliminar o risco de amplificação inespecífica. Em seguida, para extração de DNA, usando um perfurador auricular, colete uma pequena amostra de tecido de aproximadamente dois milímetros do ouvido do camundongo. Adicione 100 microlitros de tampão de lise.

Incube a amostra a 95 graus Celsius por 60 minutos, fazendo vórtices a cada 20 minutos para garantir uma lise eficiente. Após realizar o sequenciamento Sanger, analise os resultados para avaliar os resultados da edição do genoma. Para usar a análise ICE, faça upload dos dois arquivos de sequenciamento de Sanger, insira a sequência de RNA guia e selecione a nuclease apropriada usada no experimento CRISPR.

Em seguida, para usar o TIDE, faça upload dos arquivos de controle e sequenciamento experimental no formato AB1 e insira a sequência de RNA guia. A análise ICE detectou três variantes distintas de indel no local de corte Cas9, uma deleção de um par de bases em 42% das sequências, uma deleção de três pares de bases em 25% das sequências e uma deleção de 23 pares de bases em 27% das sequências. O valor de ajuste do modelo foi 0,94 e a pontuação knockout foi 69, indicando uma forte correlação prevista e provável nocaute gênico.

Cromatografias de sequência confirmaram disrupção no local de corte Cas9 na amostra editada, enquanto o cromatograma controle mostrou uma sequência intacta no mesmo local. De seis camundongos eletroporados, apenas quatro produziram filhotes com mutações, resultando em uma eficiência geral de edição de 60%. Todas as ninhadas dos seis camundongos eletroporados apresentaram redução no número de filhotes, com apenas três a quatro filhotes por camundongo.