Name: Navegando nos dados proteômicos baseados em espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a analisar dados proteômicos de espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas como DIA-NN e MSFragger. Este método permite identificar alterações de expressão gênica em cânceres como adenocarcinoma pancreático e hepatocarcinoma.

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NOTA: Consulte a Figura 1para obter uma visão geral do fluxo de trabalho e a Tabela de materiais para obter descrições detalhadas do software usado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68707/68707fig1.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do desenho do estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68707/68707fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Exemplo de arquivo e configuração de software
NOTA: Todos os aplicativos são gratuitos para uso individual em pesquisa e podem ser executados em um computador pessoal (Windows e Linux são suportados).
<ol>
	<li>Crie um novo diretório para um projeto.</li>
	<li>Baixar JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw do PRIDE. NOTA: Os dois grupos de arquivos podem ser baixados do https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 e https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 separadamente (Figura 2).</li>
	<li>Baixe e instale as ferramentas de software necessárias.<ol>
		<li>Baixe a versão mais recente do DIA-NN como um arquivo .msi. O DIA-NN está disponível gratuitamente como um arquivo .msi para Windows ou .zip arquivo para Linux a partir do https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0</li>
		<li>Baixe a versão mais recente do MSFileReader como um arquivo .exe. O MSFileReader está disponível gratuitamente como um arquivo .exe do https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, que é necessário para processar dados brutos formatados do Thermo Fisher DIA.</li>
		<li>Baixe a versão mais recente do SDK do .NET como um arquivo .exe. O SDK do .NET está disponível gratuitamente como um arquivo .exe do https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, que é necessário no Windows para executar o MSFileReader.</li>
		<li>Baixe a versão mais recente do FragPipe como um arquivo .zip. O FragPipe está disponível gratuitamente como um arquivo .zip do https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. O arquivo zip com jre é recomendado, pois contém um Java runtime para Windows, que é necessário para executar o FragPipe. O MSFragger é incorporado ao FragPipe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Baixe a versão mais recente dos arquivos de script R e Rstudio e R do Arquivo Suplementar 1 e do Arquivo Suplementar 2. R e RStudio podem ser baixados gratuitamente do https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe e https://posit.co/download/rstudio-desktop/.</li>
	<li>Descompacte os arquivos compactados e clique no ícone . exe ou .msi Arquivos para instalar os aplicativos.</li>
</ol>
2. Análise de dados DIA usando DIA-NN
<ol>
	<li>Baixe o arquivo fasta de proteoma de referência do UniProt. Para baixar o proteoma de referência do Homo sapiens (informações de isoforma não incluídas), acesse https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (Figura 3A).</li>
	<li>Clique no botão Adicionar FASTA para carregar o arquivo de proteoma de referência no DIA-NN.</li>
	<li>Selecione as duas opções FASTA digest para pesquisa sem biblioteca / geração de biblioteca e espectros baseados em aprendizado profundo, RTs e previsão de lMs na parte de geração de íons precursores. Clique no botão Executar para gerar uma biblioteca espectral prevista (Figura 3B).<ol>
		<li>Depois que o arquivo de biblioteca espectral previsto for gerado, reutilize-o para outros experimentos dentro das mesmas configurações de aquisição experimental clicando no botão Espectral para adicionar a biblioteca prevista.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Desmarque as duas opções na parte Geração de íons precursores e clique no botão Tipo que se correlaciona com o formato de arquivo na parte Entrada para carregar os dados DIA.</li>
	<li>Defina a Precisão de massa e a Precisão MS1 em Algoritmo como 0,0 ppm.</li>
	<li>Ajuste as configurações de intervalo de massa do precursor e do fragmento em Parte de geração de íons precursores com base nas configurações experimentais.</li>
	<li>Mantenha as outras configurações padrão.<ol>
		<li>A geração de precursores do DIA-NN usa tripsina / P (cliva após K / R, a menos que seja seguido por prolina) com 1 clivagem perdida para modelar a digestão parcial; desative a excisão M de N-termo para peptídeos não canônicos (por exemplo, imunopeptidomicos</li>
		<li>Habilite explicitamente as modificações variáveis (desativadas por padrão) para estudos de modificação pós-tradução (PTM) (por exemplo, Ox (M) para oxidação, K-GG para ubiquitinação) e expanda os filtros peptídicos (comprimento: 7-30 aa; carga: 1-4+; precursor m / z: 300-1800) de acordo com as configurações experimentais (por exemplo, comprimento: 5-50 aa, carga = 1-6) para grandes PTMs ou digestão não tríptica</li>
		<li>As configurações do algoritmo aproveitam a calibração automática (precisão de massa = 0,0 ppm) para alinhamento de massa preciso - substitua por tolerâncias manuais (por exemplo, 10 ppm) para instrumentos de baixa resolução - e a correspondência entre execuções (MBR) transfere IDs entre execuções (desative para amostras heterogêneas).</li>
		<li>A pontuação da rede neural aumenta a confiança na identificação (retém, a menos que os dados sejam de baixa qualidade), enquanto a Espectrometria de Massa Quant Unlabeled (UMS) permite quantificação sem rótulos de alta precisão; mudar para a quantificação MS2 para tags isobáricas (por exemplo, TMT). Use a pesquisa sem biblioteca apenas com dados DIA de alta resolução para ignorar os requisitos da biblioteca espectral.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Clique no botão Executar . Aguarde os resultados até que Concluído seja mostrado na interface de operação indicando que a execução foi concluída (Figura 3C).</li>
</ol>
3. Análise de dados DDA usando FragPipe
<ol>
	<li>Clique no ícone Fragpipe na pasta ~\FragPipe\fragpipe\bin após a instalação. Todas as configurações dependentes podem ser vistas na guia Config. Verifique se os três módulos (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN e Python) existem em seu computador. Caso contrário, baixe-os clicando em Download/Update ou Download (Figura 4A).</li>
	<li>Alterne para a próxima guia, Fluxo de trabalho. Selecione Padrão para o fluxo de trabalho e clique em Carregar fluxo de trabalho. Clique em Adicionar arquivos para adicionar caminhos de arquivo. Atribua o nome do experimento e o número da biorreplicação em Atribuir arquivos ou simplesmente deixe-o (Figura 4B).</li>
	<li>Agora, clique em Banco de dados e vá para essa guia. Carregue um arquivo fasta ou baixe qualquer arquivo fasta de acordo com a espécie das amostras. Durante o download, escolha Somente sequências revisadas, Adicionar iscas e Adicionar contaminantes comuns para uma execução simples (Figura 4C).</li>
	<li>Em seguida, clique em MSFragger para alterar a guia. Escolha a configuração padrão da Pesquisa fechada e clique em Carregar. NOTA: A pesquisa fechada é basicamente uma pesquisa pelas modificações que você definiu, enquanto a pesquisa aberta explorará todas as modificações possíveis dos dados, o que consome mais tempo e memória.</li>
	<li>Para correspondência de pico, mantenha as configurações padrão, exceto que escolher Nenhum para Calibração e otimização é recomendado, pois isso economizará tempo.</li>
	<li>Para a digestão de proteínas, ajuste os parâmetros de acordo com as condições experimentais. Mantenha as seguintes configurações padrão (Figura 5A). NOTA: As tolerâncias de massa do precursor e do fragmento (± 20 ppm) definem o erro de massa máximo permitido para combinar espectros experimentais com peptídeos teóricos, com valores mais rígidos recomendados para instrumentos de alta resolução. As regras enzimáticas (tripsina estrita) especificam a especificidade da clivagem (após K/R, a menos que seguida por P), com clivagens perdidas (2) permitindo peptídeos parcialmente digeridos. Os filtros de comprimento (5-50 resíduos) e massa (500-5000 Da) do peptídeo excluem candidatos improváveis. Modificações variáveis (por exemplo, +15,9949 Da na metionina para oxidação, +79,96633 Da em S/T/Y para fosforilação) permitem a detecção de alterações químicas, enquanto as combinações Max (5) limitam as modificações simultâneas por peptídeo para gerenciar o espaço de busca. Mods variáveis máximas por site (por exemplo, 3 em M) controla a frequência de modificação. O banco de dados dividido melhora a eficiência de grandes proteomas e o erro de isótopo (0/1/2) é responsável por picos isotópicos atribuídos incorretamente. Essas configurações equilibram coletivamente a sensibilidade, a especificidade e a carga computacional na identificação de peptídeos.</li>
	<li>Altere para a guia Validação. Desmarque Prever RT e Prever espectros, que é para dados DIA (Figura 5B).</li>
	<li>Clique na guia Quant (MS1). Selecione Executar quant MS1 e clique em Carregar padrões de quant. Selecione IonQuant e mantenha as configurações padrão (Figura 6A). Desative o MBR para tempos de retenção instáveis ou desative a normalização de intensidade se resultarem em vieses de dimensionamento global; habilite Manter índice no disco para conservar RAM com grandes conjuntos de dados. NOTA: O Quant (MS1) otimiza a quantificação sem rótulo usando MaxLPQ (MaxLFQ-based Protein Quantification, um algoritmo que estende o método MaxLFQ a grupos de proteínas), exigindo ≥1 íon exclusivo por proteína (aumente para ≥2 para maior rigor ao custo da cobertura). A correspondência entre execuções (MBR) transfere identificações entre execuções usando tolerância de tempo de retenção (RT) (padrão 0,4 min; aperte para 0,2 min para cromatografia estável ou afrouxe para variabilidade de gradiente) e tolerância de mobilidade iônica (IM) (padrão 0,05 1/k0 [mobilidade reduzida inversa]; ajuste com base na precisão IM), filtrada por ≤1% FDR (taxa de descoberta falsa; íon MBR padrão FDR=0,01; inferior a 0,005 para rigor). A inferência de proteínas usa uniquer+rascor (atribuição de peptídeos de barbear para agrupamento de proteínas). A detecção de recursos emprega tolerância de massa de 10 ppm (aumente para 20 ppm para MS de baixa resolução ou diminua para 5 ppm para alta resolução).</li>
	<li>Agora, clique na guia Executar . Selecione Diretório de saída. Clique em EXECUTAR para iniciar a análise dos dados (Figura 6B). NOTA: Para dados proteômicos sem marcação que não se concentram em modificações ou usam quantificação baseada em marcação, as guias PTMs, Glyco e Quant (Isobaric) não são usadas.</li>
</ol>
4. Análise a jusante de DIA-NN/FragPipe
NOTA: Os códigos detalhados usados neste estudo estão incluídos como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2. As versões de pacotes usadas neste estudo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 3.
<ol>
	<li>Abra o RStudio e leia os dados de expressão de proteínas gerados pelo DIA-NN ou FragPipe. Os dados da matriz do grupo de proteínas que terminam com .pg_matrix.tsv do DIA-NN e os dados combinados de proteínas que terminam com .tsv do FragPipe são normalmente usados para análise.</li>
	<li>Remova os valores ausentes sem preencher NA e filtre os grupos de proteínas identificados e quantificados com menos de dois peptídeos únicos. NOTA: Os números de DIA neste estudo foram gerados por grupos de proteínas filtradas, enquanto os números de DDA foram de grupos de proteínas não filtradas.</li>
	<li>Normalize as intensidades de proteína usando escala mediana ou normalização quantílica entre amostras. Os dados de DIA neste estudo foram normalizados por normalização mediana, enquanto os dados de DDA por normalização quantílica para melhor demonstrar os dois métodos. NOTA: A normalização mediana é robusta contra outliers e adequada para cenários em que a maioria das proteínas permanece inalterada entre as amostras, tornando a abundância mediana de proteínas um ponto de referência estável. No entanto, pode falhar em cenários com proteínas altamente expressas diferencialmente18. A normalização quantílica garante uma distribuição uniforme das abundâncias de proteínas entre as amostras, o que é útil ao comparar amostras com distribuições diferentes. Demonstrou-se que reduz o poder estatístico e pode normalizar demais os dados, potencialmente mascarando verdadeiras diferenças biológicas18. Em proteômica, a normalização mediana é amplamente utilizada em estudos sem marcação para remover vieses sistemáticos relacionados ao desempenho do instrumento MS. A normalização quantílica é preferida para conjuntos de dados em larga escala, análise de expressão diferencial e análise de cluster19,20.</li>
	<li>Calcule as alterações de log 2 vezes (por exemplo, PDAC Serum versus Normal) e os valores p do teste t. Calcular os valores-p corrigidos utilizando o método de Benjamini-Hochberg. Defina limites de significância (por exemplo, |log2FC| &gt; 1, p_adj (FDR) &lt; 0,05). NOTA: Os valores de p de corte utilizados nas figuras deste estudo representam valores brutos, pois o emprego de valores de p ajustados (p_adj) eliminaria todas as proteínas detectáveis dentro do poder estatístico desses conjuntos de dados limitados.</li>
	<li>Verifique a existência de valores ausentes/NA e exclua-os. Gere um gráfico de vulcão para visualizar ocorrências significativas.</li>
	<li>Selecione proteínas significativamente desreguladas. Aplique a normalização do escore Z aos valores de expressão da proteína. Plote um mapa de calor agrupado com anotações de grupo de amostra.</li>
	<li>Mapeie proteínas para IDs Entrez usando org. Hs.eg.db. Realizar enriquecimento GO (Processo Biológico) e análise da via KEGG. NOTA: As categorias de Processos Biológicos (BP) são comumente selecionadas na análise de Ontologia Gênica (GO) porque descrevem os processos maiores ou programas biológicos realizados por múltiplas atividades moleculares20. Esses termos se concentram em funções celulares que dão errado em doenças como o câncer, incluindo processos essenciais, como regulação do ciclo celular, processos metabólicos, etc. Além do BP, a análise GO também inclui as categorias Função Molecular (MF) e Componente Celular (CC). Os termos MF descrevem as atividades bioquímicas dos produtos gênicos, como transporte de íons ou capacidade de ligação ao DNA. Os termos CC definem os locais celulares onde os produtos gênicos desempenham suas funções, como o núcleo, a membrana mitocondrial ou o citoesqueleto.</li>
	<li>Consulte STRINGdb para interações (pontuação de confiança ≥ 400). Gere uma rede interativa usando visNetwork.</li>
</ol>

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<li>Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Post-Translational+Modification+Crosstalk+With+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).</li>
<li>Schneider, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Scalable%2C+Web-Based+Platform+for+Proteomics+Data+Processing%2C+Result+Storage+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis.</a> Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).</li>
<li>Jalili, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2020+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update.</a> Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>SDK do .NET v. 9.0.203</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://dotnet.microsoft.com/en-us/download</td></tr><tr><td>DIA-NN v. 2.1.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0&nbsp;</td></tr><tr><td>FragPipe v. 22.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases</td></tr><tr><td>MSFileReader v. 3.1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe</td></tr><tr><td>R 4.5.0</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe</td></tr><tr><td>Rstudio v. 2024.12.1+563</td><td></td><td></td><td>https://posit.co/download/rstudio-desktop/</td></tr></tbody></table>

navegando nos dados proteômicos baseados em espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas

Navigating the Mass Spectrometry-Based Proteomic Data Using Free Computational Tools

Para melhor ilustrar a busca por conjuntos de dados proteômicos, selecionamos dois tipos de conjuntos de dados para esta análise. Com o objetivo de demonstrar proteínas desreguladas em contextos clínicos, pesquisamos no PRIDE usando palavras-chave como clinic. Especificamente, selecionamos um conjunto de dados adequado para análise de DIA do Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)21, e outro adequado para análise de DDA do Chinese Human Proteome Projec...

Navegando nos dados proteômicos baseados em espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas

Mass spectrometry (MS)-based proteomics data, including Data-Dependent Acquisition (DDA) and Data-Independent Acquisition (DIA), are widely used in ...

navigating-mass-spectrometry-based-proteomic-data-using-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a purificação de peptídeos por meio do procedimento STAGE Tip. Uma coluna em miniatura contendo grânulos de resina ligados a longas cadeias de hidrocarbonetos facilita a purificação baseada em interação hidrofóbica. Ao carregar uma amostra de peptídeo pré-digerida na coluna, os fragmentos de peptídeo se ligam aos grânulos de resina, permitindo a passagem de impurezas. Um tampão de eluição que interrompe a interação hidrofóbica é aplicado para eluir os fragmentos de...

Um procedimento de ponta STAGE para dessalinização e purificação de peptídeos

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

OpenProt é um banco de dados livremente acessível que impõe um modelo policistrônico de genomas eucarióticos. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de bancos de dados OpenProt quando interrogando datasets de espectrometria de massa. Usando o OpenProt banco de dados para análise de experimentos de proteomic permite a descoberta do romance e proteínas anteriormente indetectáveis.

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Descrito é um fluxo de trabalho proteômico para identificar parceiros de interação proteica de uma fração subcelular nuclear usando enriquecimento de imunoafinidade de uma determinada proteína de interesse e espectrometria de massa sem rótulo. O fluxo de trabalho inclui fracionação subcelular, imunoprecipitação, preparação de amostras auxiliadas por filtro, limpeza off-line, espectrometria de massa e um pipeline de bioinformática a jusante.

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

Aqui, estabelecemos um método proteômico baseado em espectrometria de massa usando regiões isoladas de interesse em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Este protocolo é usado para analisar o proteoma de áreas específicas do tecido em seções de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina.

Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Aprenda a analisar dados proteômicos de espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas como DIA-NN e MSFragger. Este método permite identificar alterações de expressão gênica em cânceres como adenocarcinoma pancreático e hepatocarcinoma.

Navegando nos dados proteômicos baseados em espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas

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