Aprimorando a tecnologia de vesículas extracelulares com receptor de antígeno quimérico (CAR-EV): o futuro da terapia do câncer

Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de diagnósticos e terapias baseados em exossomos. Um objetivo é desenvolver terapias baseadas em exossomos de receptores de antígenos quiméricos, que sejam mais seguras, eficazes e acessíveis do que as terapias baseadas em células, para o tratamento de tumores colaterais. Nossas plataformas EXO-NET e EXO-ACE permitem o isolamento de exossomos escalável, reprodutível e compatível com GMP com alto rendimento e pureza, abordando as limitações dos métodos tradicionais de pesquisa e terapêutica.

EXO_NET net e EXO-ACE permitem isolamento EV rápido, escalável e compatível com GMP, com pureza e reprodutibilidade superiores, superando a centrifugação e a precipitação para pesquisa, diagnóstico e aplicações terapêuticas. Desenvolvemos um método rápido, escalável e validado para projetar CAR-EVs e fornecer terapias direcionadas de última geração, sem células. Isso fornece um fluxo de trabalho robusto que pode ser aplicado a outras condições de doença em que há necessidade clínica.

Nosso próximo objetivo é usar os métodos que desenvolvemos e validamos para gerar CAR-EVs para a entrega de terapias de RNA para o tratamento de tumores sólidos e outras doenças inflamatórias. Para começar, leve a coluna de troca iônica à temperatura ambiente, deixando-a em pé por 15 minutos. Usando uma pipeta, adicione 10 volumes de coluna de tampão de regeneração, seguidos por 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio.

Passe o meio condicionado THOD por um filtro de polietersulfona de 0,22 micrômetro. Agora, adicione até 31,2 volumes de coluna da amostra filtrada na coluna equilibrada. Em seguida, adicione 10 volumes de coluna de tampão de lavagem, seguidos por 2,5 volumes de coluna de tampão de eluição.

Colete o fluxo através do contendo as vesículas extracelulares enriquecidas. Usando filtros centrífugos de ultrafiltração de 30 kilodalton e um diluente, realize a troca de tampão no eluimento da vesícula extracelular, garantindo uma diluição mínima de 100 vezes. Ajuste o volume final da solução trocada com base nas necessidades experimentais.

Passe a amostra de vesícula extracelular enriquecida por um filtro de 0,22 micrômetro para esterilizá-la para ensaios in vitro. Determine a distribuição de tamanho, concentração e rendimento de vesículas extracelulares CAR usando análise de rastreamento de nanopartículas. Para isolamento de vesículas extracelulares pan-exossomos de alto rendimento, ligue e faça login no instrumento.

Defina as configurações para estabelecer o protocolo de isolamento de proteína HT EV. Prepare uma placa de pente de ponta colocando um pente de ponta em uma placa de 96 poços profundos. Adicione um mililitro de PBS em cada poço para preparar três placas de lavagem.

Agora, prepare uma placa de eluição pipetando 35 microlitros de tampão 1% SDS em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, prepare uma placa de encadernação adicionando um mililitro do meio condicionado. No sistema de isolamento automatizado, inicie o protocolo selecionando o programa HT EV Protein Isolation Protocol e selecione o botão play.

Abra o instrumento para começar a carregar as placas. Siga as instruções do instrumento e carregue as placas de eluição preparadas, seguidas pelas placas de poço profundo de três lavagens no instrumento. Pouco antes de carregar a placa de ligação, adicione 30 microlitros de esferas de captura de pan-exossomo em cada poço.

Carregue a placa de encadernação no instrumento, carregue a placa de pente da ponta e feche o instrumento para iniciar a encadernação. O sistema misturará a amostra de meio condicionado e as esferas magnéticas continuamente em baixa velocidade por 30 minutos, facilitando a captura eficiente de vesículas extracelulares. Após a conclusão da etapa de ligação, permita que o sistema execute três etapas de lavagem, misturando em velocidade lenta por 30 segundos para remover contaminantes não específicos.

Permita que o sistema automatizado inicie a lise da vesícula extracelular para recuperação de proteínas, realizando uma mistura de fundo de 30 segundos. Durante a incubação, o instrumento fará uma pausa de sete minutos e 30 segundos, mantendo as pontas da pipeta posicionadas acima de cada poço. Inicie outra mixagem de 30 = segundos, seguida por outra pausa de sete minutos e 30 segundos.

Quando o protocolo for concluído, o sistema levantará o pente de ponta usado, deixando a solução na placa de 96 poços e as esferas magnéticas presas às pontas. Finalmente, o instrumento prosseguirá para a etapa de saída, retornando o pente de ponta para a placa de pente de ponta. Abra o instrumento e remova as placas.

A fluorescência GFP confirmou a expressão de CAR em células T transduzidas, com localização evidente em aglomerados de células e colocalização verificada pela sobreposição de canais de campo claro e GFP. A análise de rastreamento de nanopartículas revelou uma concentração significativamente maior de vesículas extracelulares na fração EV enriquecida em comparação com o meio condicionado para as construções EGFR e HER2 CAR. O Western blotting confirmou a presença de granzima B nas células que expressam CAR e nas vesículas extracelulares isoladas, com a calnexina ausente nas vesículas extracelulares, indicando falta de contaminação celular.

As vesículas extracelulares CAR direcionadas ao EGFR reduziram significativamente a viabilidade das células de câncer de mama MCF-7 em 70% e a viabilidade das células de câncer de sangue K-562 em 40% As vesículas extracelulares CAR direcionadas ao HER2 mostraram uma redução de cerca de 10% na viabilidade das células do câncer de mama MCF-7, embora não tenham efeito observável nas células de câncer de sangue K-562.