Name: Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a reprogramar células tumorais em células dendríticas tipo 1 in vivo usando fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3 em modelos murinos. Este método converte tumores frios em quentes, potencializando a imunidade antitumoral.

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<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
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<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
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<li>Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+orchestrators+of+anticancer+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).</li>
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<li>Meiser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+stimulatory+cDC1+subpopulation+amplifies+CD8%2B+T+cell+responses+in+tumors+for+protective+anti-cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity.</a> Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).</li>
<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
<li>Balan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+human+dendritic+cell+differentiation+revealing+Notch-dependent+lineage+bifurcation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity.</a> Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).</li>
<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
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<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
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<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtro de ligação de baixa proteína, filtro de vácuo superior de garrafa de 150 mL</td><td>Fisher científico</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD45 anti-camundongo (clone: 30-F11), IgG2b de rato e kappa;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 mL)</td><td>Fisher Científico</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de falcão Corning para uso com tubos cônicos de 50ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de óculos Corning 24 x 50 mm&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade Fixável eBioscience eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Antígeno IHC eBioscience - pH Baixo (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFP [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biológicos</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM / Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM / F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco MEM (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Instituto Memorial do Parque Gibco Roswell (RPMI) 1640 Médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Solução Gibco Trypan Blue, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-rato, policlonal, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicose</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Solução HyClone de Penicilina Estreptomicina 100x (Caneta / Estreptococos)</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato HyClone (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Cetaminol vet. Solução injetável 100 mg/ml</td><td>MSD Saúde Animal Suécia</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo - C35</td><td>PFM Médico</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-CD45.2 (104), Superfície, APC, Monoclonal</td><td>Biolenda</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MHCII (M5 / 114.15.2), Superfície, PE-Cy7, Monoclonal</td><td>Biolenda</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>Soro de rato normal (estéril)</td><td>Abcam</td><td>ab7488</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de parede fina de topo aberto</td><td>Ciências da Vida Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 16% p/v aq. soln., sem metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>043368.9 milhões</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, um monocistrônico que codifica o mouse Batf3</td><td>Addgene</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, um monocistrônico que codifica o mouse Irf8</td><td>Addgene</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, um monocistrônico que codifica o mouse Pu.1</td><td>Addgene</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo SFFV-eGFP (eGFP)</td><td>Clonagem interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>Clonagem interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo SFFV-PIB-eGFP,&nbsp; um policistrônico que codifica o mouse PU.1, IRF8 e BATF3 (PIB)&nbsp;</td><td>Clonagem interna</td><td>-</td><td>Construções e vetores usados para reprogramação estão disponíveis na Asgard Therapeutics sob um contrato de transferência de material com a empresa</td></tr><tr><td>Polietilenonimina (PEI), Linear, MW 25000, Grau de Transfecção</td><td>Policiências</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de Papanicolau com Barreira Hidrofóbica ReadyProbes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão SuperFrost Plus</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x) sem vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermédio, quadrado (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Veterinário Xysol. Solução injetável 20 mg/ml</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>Células YUMM1.7</td><td>Antineo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramação in vivo tratável de células tumorais para células dendríticas convencionais tipo 1

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

Uma visão geral esquemática do protocolo de reprogramação in vivo tratável é apresentada na Figura 1. Primeiro, produzimos o vetor lentiviral policistrônico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), codificando os fatores de reprogramação instrutores de cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, seguido por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) na linha celular de empacotamento HEK 293T. Para controlar a imunogenicidade mediada por lentivírus, produzimos um vetor SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vazio, contendo um sítio de clonagem múltipla (MCS) e IRES-eGFP, mas excluindo os fatores de reprogramação. Após a produção viral, colhemos o sobrenadante contendo lentivírus e o concentramos por ultracentrifugação. Titulamos funcionalmente o vírus para determinar a quantidade necessária para atingir uma proporção de 1:1 de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-), que avaliamos no dia 3 após a transdução. Em seguida, usamos a quantidade de vírus resultante para transduzir a linhagem de células cancerígenas selecionada no dia -1. Após 24 h, coletamos as células e as implantamos por via subcutânea para estabelecer tumores. Essa estratégia garantiu que as células transduzidas fossem reprogramadas em células semelhantes a cDC1 in vivo, dentro do TME. Nos pontos de tempo indicados após o enxerto, extirpamos e processamos tumores para análises a jusante, incluindo citometria de fluxo de células tumorais dissociadas, para quantificar a eficiência de reprogramação in vivo ou coloração por imunofluorescência de seções tumorais criopreservadas para caracterizar alterações no TME.
Primeiro, para garantir a produção de altos títulos lentivirais, monitoramos as células HEK 293T antes da transfecção, visando atingir 70-80% de confluência e 24 h depois, avaliamos a eficiência da transfecção por meio da expressão de eGFP por microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em seguida, coletamos meio contendo vírus 48 h e 60 h após a transfecção, ultracentrifugamos e armazenamos em alíquotas a -80 °C (Figura 2B). Em seguida, determinamos a quantidade viral ideal necessária para atingir uma proporção de 1:1 de células eGFP+ para eGFP- em células de melanoma YUMM1.7. Semeamos 105 células YUMM1.7 por poço em uma placa de 6 poços, transduzimos as células com volumes crescentes de lentivírus e substituímos o sobrenadante contendo vírus por meio completo DMEM / F12 fresco após 24 h ( Figura 2C ). No dia 3, avaliamos a expressão de eGFP por microscopia de fluorescência, antes de quantificar as porcentagens precisas de células eGFP+ por citometria de fluxo (Figura 2C). Para quantificar a proporção de células eGFP+ para eGFP- , incluímos células vivas e únicas para excluir células mortas e dublês (Figura 2D). O volume ideal do lote de lentivírus produzido foi determinado tanto para PIB-eGFP quanto para o vírus eGFP de controle como 2 μL por 105 células YUMM1.7, resultando em 50,0 ± 0,3% e 63,0 ± 0,9% de células eGFP+ , respectivamente (Figura 2E).
Em seguida, para avaliar a eficiência de reprogramação in vivo, geramos uma linha de células cancerígenas marcadas com fluorescência (mCherry +) (YUMM1.7-mCherry). Isso garantiu que pudéssemos discriminar entre células cancerígenas e células estromais ou imunes por meio de células mCherry + vivas na análise de citometria de fluxo (Figura 3A, B). Em seguida, transduzimos células YUMM1.7-mCherry com 2 μL de PIB-eGFP ou vírus eGFP de controle por 105 células para atingir uma proporção de 1:1 eGFP+ para eGFP-. Implantamos subcutaneamente 1,6 × 106 células por tumor em camundongos CD45.1 e mantivemos uma alíquota de células para cultura in vitro para comparação. Avaliamos a eficiência de reprogramação por citometria de fluxo, bloqueando células vivas mCherry+, eGFP+ e CD45.1- para excluir células imunes do hospedeiro que engolfaram eGFP ou mCherry (Figura 3B). Dos dias 1 a 9, observamos a aquisição gradual da expressão de CD45.2 e/ou MHC-II, marcando células parcialmente reprogramadas do tipo cDC1 (CD45.2+ MHC-II- ou CD45.2- MHC-II+) e células totalmente reprogramadas do tipo cDC1 (CD45+ MHC-II+) (Figura 3C). Validamos que a reprogramação de células cancerígenas de camundongos in vivo resultou em porcentagens mais altas de células semelhantes a cDC1 no dia 9 em comparação com condições in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). A cinética de reprogramação também foi acelerada, pois observamos uma porcentagem maior de células semelhantes a cDC1 já no dia 4 (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), indicando que a presença de pistas ambientais promove uma reprogramação mais rápida e eficiente em direção a células semelhantes a cDC119. Enquanto as células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vitro estavam presentes até o dia 15, as células semelhantes a cDC1 in vivo persistiram por 9 dias, mas não foram detectadas no dia 15, sugerindo depleção do TME pelo sistema imunológico do hospedeiro ( Figura 3C ). 
Por fim, nosso objetivo foi caracterizar as alterações precoces do TME como resultado da reprogramação in vivo de cDC1 nos primeiros 9 dias. Realizamos coloração por imunofluorescência de tecidos tumorais criopreservados e seccionados de tumores eGFP e PIB-eGFP após 3 e 9 dias de reprogramação in vivo , com foco na infiltração de células imunes marcadas pelo marcador pan-hematopoiético CD45. Notavelmente, as células semelhantes a cDC1 recrutaram significativamente mais células CD45 para o TME prontamente no dia 3, em comparação com os tumores eGFP (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 intensidade média de fluorescência eGFP da coloração CD45 por área tumoral; Figura 4A, B). Curiosamente, detectamos TLS dentro do TME de tumores após 9 dias de reprogramação in vivo . Isso sugere que as células semelhantes a cDC1 podem remodelar rapidamente o TME de um ambiente "imune-frio" para um ambiente "imuno-quente" em 3 dias, o que subsequentemente leva à formação de TLS no dia 9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do protocolo para gerar células semelhantes a cDC1 por reprogramação in vivo de células cancerígenas. Os vetores lentivirais SFFV-PIB-IRES-eGFP-encoding PU.1, IRF8 e BATF3 em um policistrônico sob o controle do promotor do vírus formador de foco do baço (SFFV) e eGFP após um local de entrada do ribossomo interno (IRES) para rastrear células transduzidas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência - são produzidos na linha celular de empacotamento HEK 293T. Em seguida, os vetores lentivirais são ultracentrifugados e funcionalmente titulados para determinar a quantidade de vírus necessária para transduzir células cancerígenas em uma proporção de 1:1 eGFP+ transduzido para células eGFP- não transduzidas. Para experimentos de reprogramação in vivo , as células cancerígenas são revestidas com a quantidade ideal de lentivírus no dia -1. No dia seguinte, esta mistura 1:1 de células GFP+ transduzidas e GFP- não transduzidas é lavada e coletada para o estabelecimento de tumor subcutâneo em camundongos. Culturas paralelas in vitro são mantidas para validar a transdução no dia 3 por citometria de fluxo. Os animais são monitorados a cada 2-3 dias quanto ao crescimento e sobrevivência do tumor. Os tumores são coletados em pontos de tempo definidos, dissociados e corados para expressão de marcadores de superfície para análise de citometria de fluxo. Alternativamente, os tecidos inteiros são fixados, criopreservados e seccionados para coloração por imunofluorescência e análise de microscopia confocal. A eficiência de reprogramação in vivo é avaliada por análise de citometria de fluxo, enquanto as alterações no microambiente tumoral são caracterizadas por imagens confocais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
Figura 2: Produção e titulação funcional de lentivírus para reprogramação in vivo de cDC1. (A) Quando as células HEK 293T atingem ~ 70-80% de confluência, elas são transfectadas com uma mistura contendo 10 μg de plasmídeo de transferência SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) ou controle de vetor lentiviral vazio SFFV-eGFP (eGFP), juntamente com 7,5 μg de psPAX2 e 2,5 μg de mPD2.G e 60 μL de 1 mg / mL PEI. Imagens de microscopia de campo claro e fluorescência de células HEK 293T mostrando expressão de eGFP 24 h após a transfecção, indicando entrega bem-sucedida de plasmídeo. Barras de escala = 200 μm. (B) Representação esquemática do fluxo de trabalho de ultracentrifugação para concentrar lentivírus. O sobrenadante contendo lentivírus de células HEK 293T é coletado 48 h e 60 h após a transfecção, filtrado através de filtro PES de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm e 37 g são pesados em tubos de polipropileno de parede fina de topo aberto usando uma balança de bancada. Os tubos são ultracentrifugados em um rotor de caçamba oscilante, o sobrenadante é aspirado e o pellet seco por 5 min. Os pellets são então ressuspensos em DMEM gelado contendo HEPES e incubados durante a noite antes de aliquotar e armazenar a -80 ° C. (C) Estratégia experimental da titulação funcional para determinar a dose viral ideal para atingir uma proporção de 1: 1 de células GFP + para GFP-. Imagens de microscopia de campo claro e fluorescência mostrando a expressão de eGFP em células de melanoma YUMM1.7, 72 h após a transdução, indicando a entrega bem-sucedida dos fatores de reprogramação e eGFP. Barras de escala = 100 μm. (D) Gráficos de citometria de fluxo representativos mostrando a estratégia de gating para quantificar a proporção de células eGFP+ . As células vivas foram fechadas para a população negativa do corante de viabilidade (DAPI) seguida de exclusão dupla. (E) Quantificação por citometria de fluxo da eficiência de transdução com doses virais crescentes para determinar o volume ideal para atingir células GFP+/GFP- 1 :1. Para o lentivírus PIB-eGFP e eGFP, o volume de 2 μL por 105 células atingiu a proporção desejada. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; PEI = polietilenimina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
Figura 3: Avaliando a eficiência de reprogramação do cDC1 in vivo. (A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental para avaliar a eficiência de reprogramação do cDC1 in vivo. As células cancerígenas são inicialmente transduzidas com um lentivírus expressando mCherry para gerar uma linha celular marcada com fluorescência (YUMM1.7-mCherry), seguida de transdução com a dose otimizada de lentivírus PIB-eGFP no dia -1. As células são então injetadas por via subcutânea com uma proporção de 1:1 de células eGFP+/eGFP- no dia 0 para estabelecer tumores em camundongos CD45.1 e permitir que as células transduzidas por PIB se reprogramem em células semelhantes a cDC1 dentro do TME. Os tumores são então isolados em pontos de tempo indicados, dissociados e corados para CD45.1, CD45.2 e MHC-II usando citometria de fluxo. Isso permite a exclusão de células imunes do hospedeiro CD45.1 para quantificar in vivo a eficiência de reprogramação de cDC1 pela expressão de CD45.2 e MHC-II. Culturas in vitro paralelas são mantidas ao longo dos pontos de tempo como uma comparação com a reprogramação in vivo. (B) Gráficos de citometria de fluxo representativos ilustrando a estratégia de gating no dia 9. As células foram bloqueadas em mCherry+ e GFP+ para identificar células cancerígenas transduzidas com sucesso. As células imunes do hospedeiro foram excluídas por gating out de células CD45.1 +. (C) Quantificação da eficiência de reprogramação in vivo (à esquerda) de células YUMM1.7-mCherry por citometria de fluxo como a porcentagem de células CD45+ MHC-II+ (completamente reprogramadas) e células CD45.2+ HLA-DR- ou CD45.2- HLA-DR+ cDC1-like (parcialmente reprogramadas) controladas dentro de eGFP+ mCherry+ Células. Gráficos de citometria de fluxo representativos (à direita) mostrando a aquisição gradual da expressão de CD45.2 e MHC-II em células YUMM1.7-mCherry transduzidas por PIB-eGFP ao longo dos pontos de tempo indicados. Células YUMM1.7-mCherry transduzidas por eGFP foram usadas como controle e células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vitro foram usadas para comparação. Os dados em (C) indicam ± DP médio de 3-5 experimentos de replicação biológica. A análise estatística em (C) foi realizada para células CD45+ MHC-II+ usando o teste de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; TME = microambiente tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
Figura 4: Analisando a infiltração imune no microambiente tumoral após a reprogramação in vivo do cDC1. (A) Imagens confocais representativas mostrando células CD45+ em tumores YUMM1.7 após implantação subcutânea de células PIB-eGFP- ou células transduzidas por eGFP controle (proporção de 1:1 de células transduzidas para parentais) nos dias 3 e 9. Barras de escala = 500 μm. (B) Quantificação do MFI para coloração de CD45 em tumores YUMM1.7 tratados com PIB e transduzidos por eGFP de controle nos dias 3 e 9. Os dados em (B) indicam ± DP médio de 3-6 experimentos de replicação biológica. A análise estatística em (B) foi realizada por meio do teste de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05 e ***P &lt; 0,001. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; MFI = intensidade média de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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