Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Investigamos a programação in vivo de células cancerígenas em células semelhantes a cDC1 como uma nova estratégia de imunoterapia. Nosso objetivo é determinar se essa abordagem pode converter tumores imunes frios em imunes quentes, anunciando assim a imunidade antitumoral. Abordamos as limitações das atuais estratégias de geração de cDC1 in vivo, apresentando um protocolo para converter células cancerígenas em células imunogênicas semelhantes a cDC1 diretamente dentro do tumor, permitindo o estudo de respostas imunes impulsionadas por cDC1 in situ.

Nosso protocolo de programação in vivo tratável gera de forma confiável células imunogênicas maduras semelhantes a cDC1, superando o microambiente tumoral supressor e, como essas células são geradas diretamente in vivo, essa abordagem elimina a necessidade de fabricação de células imunes in vitro. Nossas descobertas estabelecem uma base para traduzir a reprogramação mediada por fator de transcrição in vivo para a clínica, introduzindo imunoterapia contra o câncer pronta para uso, mas personalizada, que provoca respostas imunes antitumorais duráveis. Seguindo em frente, estamos investigando como a reprogramação de células semelhantes a cDC1 pode provocar a formação de terciário e infraestrutura e se isso se traduz em imunidade humoral.

Além disso, também estamos explorando sua potencial sinergia com outras abordagens imunoterapêuticas. Para começar, cultive as células HEK 293T até atingirem 70 a 80% de confluência. Agora, vortex a mistura de transfecção preparada contendo o plasmídeo de transferência completamente por um minuto e incube a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação do complexo lipídico do DNA.

Aspire o meio das células HEK 293T e adicione 10 mililitros de DMEM sem penicilina estreptomicina e suplementado com 10% de FBS. Em seguida, adicione a mistura de transfecção gota a gota às placas de 150 milímetros e incube por 16 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, substitua o meio por 20 mililitros de meio completo DMEM suplementado com um butirato de sódio milimolar e incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, colete o sobrenadante contendo lentivírus em um tubo cônico de 50 mililitros 48 e 60 horas após a transfecção. Após a primeira coleta, adicionar 12 mililitros de DMEM completo pré-aquecido por placa de 150 milímetros para a segunda colheita. Filtre o líquido coletado através de um filtro de polietersulfona de baixa ligação a proteínas de 0,45 micrômetro.

Pipete 37 gramas do meio contendo lentivírus em tubos de polipropileno de parede fina de 38,5 mililitros. Centrifugue os tubos em um rotor de balde oscilante a 25.000 G por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

Coloque os tubos de polipropileno de parede fina superior aberta de cabeça para baixo em um lenço umedecido de laboratório ou material absorvente semelhante por cinco minutos para drenar o excesso de líquido e secar o pellet. Em seguida, adicione 200 microlitros de DMEM gelado suplementado com HEPES ou PBS a cada pellet e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga colocado em um tubo cônico de 50 mililitros. Incube o pellet durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ressuspensão completa.

Combine todos os pellets ressuspensos em um único recipiente, aliquote o estoque viral em volumes menores entre 50 e 200 microlitros e armazene a 80 graus Celsius negativos para uso a longo prazo. Após a expansão das células cancerígenas, prepare as suspensões celulares para transdução para atingir uma proporção próxima de um para um de células EGFP positivas para EGFP negativas no terceiro dia. Adicionar oito microgramas por mililitro de polibriro à suspensão celular, seguidos do volume adequado de lentivírus, conforme previamente determinado.

Misture o conteúdo delicadamente sem gerar bolhas. Agora, pipete dois mililitros da suspensão de células preparadas contendo uma vez 10 elevado a cinco células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços e incube por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, remova o meio contendo lentivírus de cada poço.

Lave os poços duas vezes com PBS. Adicione 500 microlitros de tripsina a cada poço e incube por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, examine os poços sob um microscópio óptico para confirmar o descolamento completo da célula da placa.

Em seguida, colete as células usando meios completos em tubos cônicos de 50 mililitros. Centrifugue as células por cinco minutos a 350 G para pelletá-las. Lave o pellet com PBS.

Pegue uma alíquota e avalie a contagem de células viáveis usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano. Em seguida, ressuspenda o pellet celular final em PBS gelado para atingir uma concentração de duas a quatro vezes 10 elevado a sete células por mililitro, correspondendo a uma a duas vezes 10 elevado a seis células em 50 microlitros por tumor. Coloque as células no gelo e reposicione-as para a área de experimento com animais.

Depois de anestesiar o camundongo CD45.1, coloque-o em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Aplique creme para os olhos no mouse para evitar a desidratação ocular durante a anestesia. Usando uma navalha, raspe o flanco direito do mouse.

Opcionalmente, marque o mouse com um cortador de orelha. Desinfete a área raspada e remova os pelos restantes com um cotonete embebido em etanol a 70%. Agora, usando uma pipeta P1000, ressuspenda completamente as células cancerígenas.

Carregue a suspensão de célula totalmente ressuspensa em uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 30. Levante suavemente a pele do flanco raspado do mouse usando dois dedos e insira a ponta da agulha da seringa no vinco formado pela pele levantada. Solte a pele levantada enquanto segura a seringa no lugar com uma mão.

Use a outra mão para esticar a parte superior da pele com dois dedos. Injete lentamente 50 microlitros da suspensão de células cancerígenas para criar um inchaço subcutâneo oval visível no local da injeção. Após o procedimento de injeção, monitore o animal até que ele acorde completamente da anestesia para garantir a sobrevivência.

As células HEK 293T transfectadas com o plasmídeo SFFV-PIB-eGFP mostraram expressão clara de eGFP 24 horas após a transfecção, confirmando a entrega bem-sucedida do plasma. 72 horas após a transdução, as células de melanoma indicaram a entrega bem-sucedida dos fatores de reprogramação e eGFP. No nono dia após a implantação das células, a reprogramação in vivo produziu uma porcentagem maior de células totalmente reprogramadas CD45-positivas, MHC-II-positivas, cDC1-like do que em condições in vitro.

No terceiro dia após o implante, os tumores PIB-eGFP mostraram infiltração de células imunes CD45-positivas marcadamente maior do que os controles de eGFP, indicando remodelação imunológica precoce. No nono dia, a intensidade média de fluorescência de CD45 por área tumoral permaneceu significativamente maior em tumores PIB-eGFP do que nos controles. As estruturas linfóides terciárias tornaram-se detectáveis em tumores PIB-eGFP no nono dia, indicando alterações imunes estruturais no microambiente tumoral.