SCAnED - Uma macro de segmentação de pele de código aberto para detecção semiautomatizada de células e núcleos em compartimentos epidérmicos e dérmicos da pele

Em nosso trabalho, investigamos mecanismos regulatórios que mantêm a homeostase dos tecidos em níveis molecular, celular, estrutural e mecânico. Nosso objetivo é entender condições patológicas, como inflamação de pele ou câncer. Com novas ferramentas de imagem de alta resolução e multiômica, agora podemos mapear mudanças de expressão celular e gênica nos tecidos em 2D e 3D.

Isso está realmente acelerando nossa compreensão de como as doenças se desenvolvem e progridem. Um dos grandes desafios atualmente é a enorme quantidade de dados gerados pela microscopia avançada. E embora existam mais ferramentas disponíveis para analisar imagens, elas geralmente não são fáceis de usar para pessoas sem muita experiência, ou são bastante caras.

Nosso protocolo oferece uma ferramenta gratuita e fácil de usar para analisar células da pele humana tanto na epiderme quanto na derme. Isso melhora a precisão em relação às ferramentas gerais e não exige experiência prévia em programação ou análise de imagens. Para começar, abra as imagens de imunofluorescência em Fiji ou na Imagem J, usando formatos bio com as configurações padrão.

Não divida os canais durante essa etapa. Baixe a macro SCAnED e execute selecionando plugins. Depois macros e clicar em correr.

Selecione o arquivo de script macro SCAnED quando solicitado. Siga as instruções na tela fornecidas pela macro. Selecione o canal E-cadherin quando solicitado pela macro.

Em seguida, navegue até a imagem, escolha ajustar, depois limiar para ajustar manualmente o limiar do canal E-cadherin. Clique em OK assim que a região epidérmica estiver totalmente capturada. Depois, selecione o canal DAP-E quando solicitado para prosseguir com a segmentação.

Defina automaticamente os níveis de intensidade para segmentação de núcleos ao usar a função limiar. Para o StarDist, abra o plugin na Imagem J. Carregue o modelo de detecção de núcleos na interface gráfica do StarDist e clique no canal dos núcleos para selecioná-lo para análise. Agora, ajuste as configurações de tile no StarDist para corresponder ao tamanho esperado do patch de 256 por 256 pixels.

Quando solicitado, selecione sim para medir a intensidade do marcador dentro dos núcleos. Depois, repita o processo de segmentação e análise para cada canal de fluorescência. Após todos os canais serem processados, salve os dados de saída como arquivos de valores separados por vírgulas conforme instruído pela macro.

Para a região citoplasmática, quando a segmentação do núcleo foi realizada usando a função limiar, aplica-se dilatação binária para expandir a região nuclear de interesse. Quando o StarDist for usado para segmentação de núcleos, aplique expansão por ampliação à região nuclear de interesse. Selecione sim quando solicitado para medir a intensidade do marcador em toda a região celular.

Depois, salve os arquivos de dados resultantes como formato de valor separado por vírgulas de acordo com instruções macro. Estabeleça limiares de intensidade específicos para marcadores usando amostras controle de isotipo. Baixe o caderno Jupyter apropriado e navegue até o Google Collab para selecionar o arquivo, seguido do bloco aberto.

Escolha o arquivo e execute as células de código sequencialmente. Quando solicitado na opção escolher arquivos, clique no botão e envie o arquivo de valores separados por vírgula. Para cada anticorpo, calcule a intensidade média de fluorescência usando os arquivos controle de isotipo.

Para determinar os limiares de corte, abra o caderno de pontos gráficos, envie os dados de controle do isotipo e execute o código. Com base na distribuição dos pontos nos gráficos tanto para controle de isotipo quanto para dados específicos de anticorpos, selecione um limiar de intensidade para distinguir o sinal de fundo da expressão verdadeira do marcador. Use esse limiar para classificar cada célula como positiva ou negativa para o marcador dado.

Por fim, crie gráficos de pontos para visualizar padrões de coexpressão dos marcadores rodando o código do gráfico de pontos no caderno Google Colaps. Em imagens segmentadas manualmente, células positivas para vimentina apresentaram um forte sinal citoplasmático com limites claros de retorno do investimento cobrindo todo o corpo celular. A segmentação semi-automatizada SCAnED capturou células positivas para vimentina com limites semelhantes usando uma abordagem de limiar e dilatação.

A comparação quantitativa da intensidade da vimentina em 21 células não mostrou diferença significativa entre segmentação manual e segmentação SCAnED. A análise histográfica revelou uma frequência maior de células positivas para vimentina na derme da psoríase em comparação com pele saudável. A análise do gráfico de pontos em células dérmicas mostrou aumento de células positivas para CD-90 positivas à vimentina na psoríase em comparação com pele saudável.

Na epiderme, amostras de psoríase mostraram aumento de células negativas a vimentina positivas para CD-90, possivelmente queratinócitos, em comparação com pele saudável. As contagens celulares positivas para vimentina na epiderme psoriásica e saudável foram comparáveis entre SCAnED e QuPath. a segmentação visual mostrou que o SCAnED atribuiu células de borda à epiderme com mais precisão do que o QuPath, que atribuiu incorretamente várias.