Desenvolvimento de Linhagens Organoides Derivadas de Camundongos a partir de Células Epiteliais da Trompa de Falópio para Modelagem de Carcinoma Seroso de Ovário de Alto Grau

Então sim, atualmente estamos trabalhando no desenvolvimento de novos modelos de carcinoma seroso do ovário de alto grau, modelos que são sincênicos no sentido que o protocolo descreve. Pegamos as trompas de Falópio saudáveis de camundongos saudáveis e as derivamos como organoides na placa de Petri, e então lhes damos todos os diferentes erros ou modificações genéticas que normalmente encontraríamos em uma versão humana normal da doença. Isso é muito interessante porque, de um lado, você pode estudar todos os tipos de fatores intrínsecos desses tumores dentro da placa de Petri como organoides, que são mais realistas do que culturas tradicionais em 2D.

Mas a questão é que, como existem modelos sintéticos, você pode pegar esses organoides e colocá-los de volta em um mouse, e então ver como o tumor realmente se desenvolve e interage com o hospedeiro. Isso nos permite ter uma visão muito mais holística de como um tumor e a tumorigênese realmente acontecem, o que esperamos que nos dê ferramentas muito melhores e uma compreensão muito melhor de como essa doença realmente funciona e como combatê-la melhor. Para começar, obtenha fêmeas de camundongos pretos 6J C57 eutanasiados.

Remova o ovário e a trompa de Falópio e transfira-os para uma placa de Petri estéril contendo DMEM, suplementada com penicilina estreptomicina a quatro graus Celsius. Use um microscópio dissecador, pinças finas e tesouras para remover a gordura residual do ovário. Isole a trompa de Falópio, incluindo o fundíbulo e parte da ampola distal, do ovário e do útero.

Agora transfira o tecido limpo para um tubo contendo a mistura digestiva completa. Com uma tesoura fina, triture a trompa de Falópio em pedaços menores que 0,5 milímetros. Em seguida, incube o tubo a 37 graus Celsius por 40 a 50 minutos antes de realizar o cultivo de organoides.

Para desenvolver o modelo do tumor de camundongo, instale-se cinco injeções, cada uma contendo quatro milhões de células ressussestas em Opti-MEM I não suplementada, uma matriz de membrana basal gelada. Para preparar as injeções, primeiro expulse bolhas de ar do volume morto de uma seringa de insulina U-100 equipada com uma agulha calibre 28 usando PBS frio. Depois, carregue lentamente a seringa com 40 microlitros de células e mantenha as seringas carregadas no gelo até que os camundongos sejam anestesiados.

Quando estiver pronto para injeção, coloque as seringas ao lado de uma lâmpada de aquecimento para permitir que a matriz da membrana do embasamento aqueça e aumente a viscosidade, auxiliando na injeção e no entralto. Em seguida, coloque um rato em uma gaiola pré-aquecida sob uma lâmpada aquecida para se preparar para a cirurgia. Faça uma incisão a menos de um centímetro ao longo do flanco, acima da coxa de um camundongo anestesiado.

Corte a epiderme e a hipoderme para alcançar a região bursa. Puxe suavemente o ovário localizando a almofada adiposa anexada. Depois, usando uma seringa preparada, injete as células através da almofada adiposa e do ovário no saco do oviduto.

Cuidadosamente devolva o ovário à bursa. Feche a camada muscular usando pontos não trançados. Em seguida, feche a incisão cutânea usando grampos cirúrgicos.

Coloque o rato de volta na gaiola aquecida e mantenha a temperatura corporal com uma lâmpada aquecida até ficar semiconsciente, geralmente por mais de 15 minutos. Organoides derivados do epitélio da trompa de Falópio murino apresentam uma forma esférica bem definida e clara após cerca de cinco dias, e requerem embalagem entre o dia 10 e o 12. Os organoides do tipo selvagem são transformados em tumoroides pré-cancerosos usando técnicas de engenharia genética, como a superexpressão gênica lentiviral ou retroviral.

Linhas celulares clonadas únicas derivadas dos organoides geneticamente modificados podem ser estudadas in vivo por injeção na bursa ovariana. Os tumores normalmente atingem um tamanho de dois a três centímetros por volta de 60 dias após a injeção. Bem, dizemos que, como eu disse antes, a maior vantagem do jeito que esse protocolo funciona, claro, é gerar esses modelos sintéticos, certo?

E como eles são sintéticos, como eu disse antes, você realmente pode apreciar toda a interação entre, sabe, um animal completo, um rato completo, sabe, e o tumor que você está desenvolvendo enquanto tem, sabe, controle total sobre a genética do tumor. Então, claro, comparado a outros modelos onde talvez você tente entender o sistema imunológico dentro da placa de Petri, será muito difícil replicar o sistema imunológico na placa de Petri. Ou se você pegar PDXs, como amostras, amostras de tumores de pacientes que depois colocam em camundongos, para que isso funcione, os camundongos não podem ter sistema imunológico, senão ele vai rejeitar esse tumor, certo?

Mas como esse modelo é singênico, é possível realmente apreciar toda a interação do hospedeiro inteiro com o tumor e, especialmente, com o sistema imunológico, que atualmente é uma das áreas de pesquisa mais quentes na área. Então, realmente acho que esse é o benefício mais importante desse protocolo em comparação com outros protocolos que você encontra em outros lugares. Então, na verdade, já temos usado esses modelos para investigar alguns fenômenos muito interessantes.

Eu diria que o que mais me interessa agora é como o sistema imunológico adaptativo, pelo que vimos, parece ser um grande contribuinte na formação das propriedades genômicas, especialmente variações do número de cópias dos carcinomas serosos do ovário de alto grau, no sentido de que, se o sistema imunológico não estiver presente, parece que esses tumores não desenvolvem rearranjos tão massivos e complexos do DNA. Então, estamos tentando descobrir como isso acontece e como, com sorte, poderíamos tentar reverter para potencializar qualquer tipo de terapia imunológica contra isso.