Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Este projeto tem como objetivo desenvolver um método de alto rendimento para otimizar e caracterizar uma ferramenta optogenética multicomponente chamada LACE para expressão gênica em mamíferos. Para começar, coloque um frasco de cultura celular contendo células HEK 293 T dentro de um gabinete de biossegurança. Use uma pipeta sorológica para aspirar o meio gasto.

Pipete 10 mililitros de DPBS em um canto do frasco e gire suavemente para lavar as células. Depois, aspire a solução de lavagem e descarte tanto o DPBS quanto o aspirador no recipiente de resíduos. Agora adicione 1,5 mililitro de 0,05% de Tripsina-EDTA ao frasco para cobrir a superfície e incube.

Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície. Em seguida, pipete 8,5 mililitros de DMEM fresco no frasco. Aspire a solução para cima e para baixo até que nenhum agregado fique visível para resuspender as células.

Depois, transfere nove mililitros da suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione nove mililitros de DMEM fresco ao frasco. Incube a suspensão até confluência abaixo de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.

Agora, misture 10 microlitros das células suspensas com 10 microlitros de corante de tripsina em proporção um-para-um para calcular a concentração celular usando um hemocitômetro. Semeie aproximadamente 35.000 células em 100 microlitros em cada poço de uma placa preta de alto desempenho, com 96 poços, com fundo de vidro. Coloque a placa em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Para transfecção, primeiro coloque 11 microlitros de DMEM quente sem soro em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro para um poço e 10% de excesso. Prepare várias razões de massa plasmídica da proteína fluorescente verde aprimorada por CRY2 para RNA/Aliquota guiada por CIBN, 110 nanogramas por poço das soluções preparadas em cada tubo contendo as alíquotas do meio sem soro. Depois, pipetee mais 11 microlitros de DMEM sem soro para cada poço em tubos separados para diluição do reagente de transfecção.

Adicione o reagente de transfecção diluído à mistura do meio de DNA e incube para formar os complexos de transfecção. Em seguida, pipetei 20 microlitros do complexo de transfecção preparado para cada poço da placa de 96 poços contendo as células T HEK 293. Embrulhe a placa de 96 poços em papel alumínio e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Para iniciar o processo de ativação, modifique o código de entrada do microcontrolador para iluminar os poços desejados usando as linhas de script especificadas. Ajuste a intensidade do diodo emissor de luz para 9,27 miliwatts por centímetro quadrado usando as linhas de código indicadas. Ajuste o comprimento do pulso para um segundo, depois ajuste a frequência do pulso para 0,067 hertz, equivalente a cada 15 segundos.

Borrife a tampa impressa em 3D da optoPlate com etanol 70%. Depois, deixe secar em um armário de biossegurança. Agora, acenda uma lâmpada de luz vermelha no laboratório escuro.

Coloque a placa de 96 poços no gabinete de biossegurança. Troque a tampa do prato pela tampa seca impressa em 3D. Coloque a placa de 96 poços sobre o conjunto de LEDs para montar o aparelho de ativação.

Coloque o aparelho totalmente montado em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Conecte o microcontrolador, o diodo emissor de luz e as portas do ventilador a uma fonte de energia. Para realizar citometria de fluxo, execute o programa de inicialização do sistema no software especialista do local.

Coloque dois mililitros de água desionizada no carregador de amostras. Execute o controle de qualidade usando as contas de controle de qualidade fornecidas. Configure e especifique os poços de amostra para aquisição.

Crie os gráficos e tabelas para dispersão lateral versus direção, altura de dispersão lateral versus área de dispersão lateral, área de dispersão lateral versus FITC-A e a tabela de estatísticas FITC-A. Agora, encaixe a placa de 960 poços em V no carregador de placas do citômetro. Selecione um poço não transfectado e clique em Inicializar, seguido de Executar.

Ajuste as tensões de dispersão lateral e FITC para centralizar a população de interesse no gráfico SSC-A versus FSC-A. Clique em Executar, depois selecione uma proteína fluorescente verde com CMV bem transfectada. Ajuste a tensão do FITC para incluir tanto células autofluorescentes quanto fluorescentes no gráfico SSC-A versus FITC-A.

Crie um polígono para bloquear a população celular saudável. Um segundo polígono para bloquear para discriminação de duplos no gráfico SSC-H versus SSC-A. Crie uma porta de polígono para distinguir células fluorescentes das não fluorescentes, usando a porta das células não transfectadas como referência.

Gravem automaticamente as amostras a 60 microlitros por minuto até que 200 segundos tenham se passado ou 10.000 eventos sejam atingidos. Depois, exporte os valores médios do FITC como um arquivo CSV e analise os dados. Limpe o citometro de fluxo selecionando a opção de limpeza diária.

Imagens por fluorescência mostraram que, em uma razão de massa de um para nove, a ativação da luz azul induzia uma expressão máxima de eGFP menor em comparação com a razão de cinco para cinco, que também apresentou aumento de vazamento na condição escura. A citometria de fluxo mostrou que mais de 95% dos eventos com portas em P1 foram singlets em todas as condições. E as células não transfectadas apresentaram menos de 0,1% de população positiva para eGFP.

O controle CMV-eGFP apresentou aproximadamente 99% de células positivas para eGFP, enquanto células transfectadas com 2pLACE apresentaram aproximadamente 57%. As células transfectadas com CMV-eGFP apresentaram forte expressão constitutiva de eGFP tanto em condições claras quanto escuras, enquanto as células não transfectadas não apresentaram fluorescência visível. Também confirmou a transfecção bem-sucedida de 2pLACE e a ativação da expressão de eGFP sob luz azul com expressão menor que a CMVeGFP. Foi observado um aumento triplicado na expressão de eGFP em amostras de 2pLACE ativadas por luz em comparação com condições escuras.

A porcentagem de células eGFP-positivas em amostras transfectadas com 2pLACE foi de aproximadamente 60%. A proporção de massa de três para sete produziu a maior intensidade média de fluorescência e faixa dinâmica. Esse protocolo permite a avaliação de alta taxa de amostras e replicação técnica usando o optoPlate para programar condições de luz e frequências de pulso variadas.