Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

As armadilhas extracelulares de neutrófilos estão envolvidas em uma variedade de doenças, incluindo doenças cardiovasculares. No entanto, os efeitos sinérgicos da formação de TNE e lipoproteínas nas células vasculares permanecem obscuros. Utilizando este protocolo, a análise mecanística está em andamento até o momento como as respostas inflamatórias são induzidas em células endoteliais da aorta humana tratadas com armadilhas extracelulares de neutrófilos e lipoproteína de baixa densidade.

Demonstramos que a lipoproteína de alta densidade atua como um supressor da formação de NET. Isso é promovido por lipoproteína de baixa densidade oxidada, fosfolipídios oxidados e lisofosfolipídios. Para começar, centrifugue de 45 a 50 mililitros de sangue total humano obtido em um tubo de heparina a 700 G por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Reduza lentamente a velocidade da centrífuga após a centrifugação e, em seguida, colete a camada superior contendo a fração de plasma. Centrifugar a fracção plasmática duas vezes a 700 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius para remover completamente as células sanguíneas, mantendo a mesma desaceleração. Em seguida, adicione um microlitro de solução de EDTA a 250 milimolares por um mililitro de plasma para evitar a oxidação de lipoproteínas mediada por íons metálicos divalentes.

Coloque 2,7 mililitros de plasma no tubo da ultracentrífuga. Sobreposição com 900 microlitros de PBS contendo 250 EDTA micromolar. Em seguida, ultracentrifugar o tubo a 600 000 G durante sete minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, descarte 900 microlitros da camada superior para eliminar a fração quilomícron. Adicione 900 microlitros de PBS contendo EDTA em cima do plasma restante e ultracentrifugue a 600.000 G por 2,5 horas a quatro graus Celsius. Descarte 900 microlitros da camada superior para eliminar a fração de lipoproteína de densidade muito baixa.

Em seguida, adicione 540 microlitros de 0,5 gramas por mililitro de solução de brometo de potássio ao plasma para ajustar a densidade para 1,063. Misturar o conteúdo delicadamente com uma pipeta e uma ultracentrífuga a 600 000 g durante 2,5 horas a quatro graus Celsius. Colete 540 microlitros da camada superior contendo lipoproteína de baixa densidade.

Transfira a fração coletada para uma membrana de diálise e dialise contra dois litros de PBS contendo EDTA a quatro graus Celsius no escuro para eliminar o brometo de potássio. Adicione 152 microlitros de solução de polilisina a 0,01% ou gelatina a 0,1% a cada poço de uma placa de 12 poços e incube em temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Em seguida, remova a solução dos poços, lave uma vez com 200 microlitros de água estéril e deixe os poços secarem completamente em temperatura ambiente.

Armazene o prato preparado em temperatura ambiente até uso posterior. Preparar as placas revestidas de gelatina seguindo o mesmo procedimento que o demonstrado para a polilisina. Cultura duas vezes dez elevado a seis células HL60 por 10 mililitros em meio RPMI-1640, suplementado com dois micromolares de ácido trans-retinóico.

Após quatro dias de incubação com ácido totalmente trans-retinóico, colete as células HL60. Centrifugue as células coletadas a 220 G por quatro minutos a 18 a 22 graus Celsius. Aspire o sobrenadante e, em seguida, lave as células com um volume igual de meio RPMI-1640 sem soro.

Centrifugar novamente as células lavadas a 220 G durante quatro minutos a 18 a 22 graus Celsius e ressuspender as células em meio RPMI-1640 isento de soro. Depois de ajustar a concentração celular para duas vezes dez elevado a seis células por mililitro, semeie 0,5 mililitro da suspensão em cada poço de uma placa de 12 poços pré-revestida com polilisina. Adicione 100 microlitros de meio RPMI-1640 sem soro com ou sem 300 nanomolares de forbol 12-miristato 13-acetato ou PMA.

Cultive as células por 30 minutos. Em seguida, remova o meio dos poços. Lave as células uma vez com meio RPMI-1640 sem soro e substitua-o por RPMI-1640 sem soro contendo zero ou 20 microgramas por mililitro de lipoproteína de baixa densidade.

Continue cultivando as células por duas horas. Colete o meio de cultura de cada poço em um tubo e centrifugue a 700 G por três minutos a 18 a 22 graus Celsius para remover os detritos celulares. Para estimulação, obter a cultura de células endoteliais da aorta humana e substituir o meio gasto por 0,5 mililitro de meio de cultura fresco e incubar as células por 30 minutos.

Finalmente, adicione 167 microlitros do meio de cultura coletado de células semelhantes a neutrófilos contendo armadilhas extracelulares de neutrófilos e LDL às placas de células endoteliais da aorta humana. A estimulação de células endoteliais da aorta humana com armadilhas extracelulares de neutrófilos levou a mudanças morfológicas dependentes da dose de uma forma semelhante a paralelepípedos para uma forma alongada. As alterações morfológicas nas células endoteliais da aorta humana foram aumentadas quando estimuladas com armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por LDL, com alongamento visível aparente em seis horas.