Name: Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a estimular células endoteliais aórticas humanas usando armadilhas extracelulares de neutrófilos e lipoproteína de baixa densidade. Este método permite analisar respostas inflamatórias em doenças cardiovasculares.

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<ol><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).</li>
<li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).</li>
<li>Meher, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+IL+%28Interleukin%29-1%CE%B2+in+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).</li>
<li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-specific+deletion+of+Peptidylarginine+Deiminase+4+mitigates+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis.</a> Front Immunol. 9, 1680(2018).</li>
<li>Zhai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+from+activated+vascular+smooth+muscle+cells+drive+the+progression+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis.</a> Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).</li>
<li>Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+modified+by+myeloperoxidase+oxidants+induces+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction.</a> Redox Biol. 13, 623-632 (2017).</li>
<li>Mueller, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+lipoprotein+%28a%29+Isolation+from+a+small+volume+of+plasma+with+applications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research.</a> Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).</li>
<li>Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+redox-cycling+nitroxide+tempol+inhibits+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation.</a> Front Immunol. 3, 391(2012).</li>
<li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+endothelial+cells+induce+neutrophil+extracellular+traps+and+are+susceptible+to+NETosis-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death.</a> FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+action+of+oxidized+low-density+lipoproteins+and+neutrophils+on+endothelial+inflammatory+responses+through+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation.</a> Front Immunol. 10, 1899(2019).</li>
<li>Schröter, J., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorinated+phospholipids+and+fatty+acids%3A+Patho%29physiological+relevance%2C+potential+toxicity%2C+and+analysis+of+lipid+chlorohydrins%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).</li>
<li>Nose, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+perilipin-3+%28TIP47%29+in+formation+of+lipid+droplets+and+PGE2+production+in+HL-60-derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils.</a> PLoS One. 8 (8), e71542(2013).</li>
<li>Manda-Handzlik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+agents+differentiating+HL-60+cells+toward+granulocyte-like+cells+on+their+ability+to+release+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps.</a> Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+suppresses+neutrophil+extracellular+traps+enhanced+by+oxidized+low-density+lipoprotein+or+oxidized+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).</li>
<li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+derived+from+macrophages%2C+mast+cells%2C+eosinophils%2C+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+eosinophils+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease.</a> Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,1% de poli-L-lisina</td><td>SigmaAldrich</td><td>Rolamento P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 10 cm</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Falcão</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2% de gelatina</td><td>SigmaAldrich</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>tubo 4PC</td><td>Himac</td><td>S404332A</td><td></td></tr><tr><td>ácido retinóico totalmente trans</td><td>Wako</td><td>188-01113</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Tubo de diálise Cellurose</td><td>MISUMI Group Inc.</td><td>0327-23-37-07 (UC18-32-100)</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>345-01865</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Kit de Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22111</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Heparina sódica (5.000 unidades/5 mL)</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade</td><td>TOMY</td><td>SRX-201</td><td>Aceleração: 9, Desaceleração: 7</td></tr><tr><td>células endoteliais da aorta humana</td><td>Lonza</td><td>CC-2535</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>Wako</td><td>168-03475</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Software de microscopia KEYENCE</td><td>KEYENCE</td><td>Analisador BZ-II</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ultracentrífuga</td><td>Himac</td><td>CS150GX</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia</td><td>OLIMPO</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td>Para imagens de lapso de tempo (opcional)</td></tr><tr><td>Câmera de microscopia</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi3</td><td></td></tr><tr><td>Software para câmera de microscopia</td><td>Nikon</td><td>DS-L4</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122 100ML</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>tampão fosfato salino (&times; 10)</td><td></td><td></td><td>Dissolver 2,6 g de NaH2PO4&middot; 2H2O, 29 g de Na2HPO4&middot; 12H2O, 80 g de NaCl e 2,0 g de KCl em água destilada e ajustar ao volume de 1 L. (Pode ser substituído por qualquer fornecedor)</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Miristato 13-Acetato)</td><td>Wako</td><td>162-23591</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>(CC-5022: Solução salina tamponada com HEPES, CC-5012: Tripsina/EDTA, CC-5002: Solução neutralizante de tripsina)&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Himac</td><td>S100AT6-0242</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 (com vermelho de fenol)</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sem vermelho de fenol)</td><td>Wako</td><td>186-02155</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Balão T-25</td><td>Corning</td><td>3275</td><td></td></tr></tbody></table>

estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

Stimulation of Vascular Endothelial Cells Using Neutrophil Extracellular Traps in the Presence of Low-Density Lipoprotein

Após a remoção dos quilomícrons, seguida de frações VLDL do plasma humano por meio de ultracentrifugação sequencial, o plasma humano foi misturado com uma solução KBr para ajustar a densidade para d = 1,063. Nesta etapa, o precipitante remanescente não foi completamente dissolvido na solução, e a mistura severa, que criou bolhas de gás, foi evitada para manter o LDL intacto. Após a ultracentrifugação, o LDL foi avaliado visualmente na camada superior por sua cor amarelo-alaranjada9 (<stro...

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

Neutrophil extracellular traps (NETs) have emerged as causative factors in various non-infectious diseases and have been implicated in cardiovascular ...

stimulation-vascular-endothelial-cells-using-neutrophil-extracellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Este vídeo demonstra a estimulação in vitro de armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) em macrófagos derivados de monócitos humanos usando diferentes estímulos inflamatórios, como TNF-alfa, PMA e HOCL. O vídeo também demonstra o método de coloração com corante SYTOX de METs para visualização.

Estimulação in vitro e visualização de armadilhas extracelulares de macrófagos

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda a estimular células endoteliais aórticas humanas usando armadilhas extracelulares de neutrófilos e lipoproteína de baixa densidade. Este método permite analisar respostas inflamatórias em doenças cardiovasculares.

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade (Vídeo) | JoVE Journal

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

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